韓宗蘭，王蘭英，王海楠

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)作為兒科臨床診治過程中的一種罕見疾病之一，其發(fā)生與機體苯丙氨酸(PA)代謝途中缺乏苯丙氨酸羥化酶(PAH)而使其不能轉變成酪氨酸有關，和酮酸(keto acid，KA)蓄積也息息相關[1]，屬常見的氨基酸代謝病之一。國家衛(wèi)生健康委員會等5部門已于2018年5月11日將其收入《第一批罕見病目錄》[2]中。PKU的臨床表現(xiàn)不均一，病人常表現(xiàn)為智力低下、精神神經(jīng)異常及濕疹、皮膚抓痕征等。這不僅嚴重影響了病人的生命安全與生活質量，也增加了社會負擔。據(jù)統(tǒng)計[3]，中國的PKU發(fā)病率約0.01%，北方患病率顯著高于南方，可見該病有顯著的地域性特征。相關研究[4]證實，多數(shù)PKU病人是由于苯丙氨酸羥化酶基因突變而導致機體細胞內的PAH缺乏或功能下降，繼而迫使PA在血液中呈高表達，而在其代謝途中損害腦及神經(jīng)細胞。既往研究[5]表明PAH突變檢測對增強PKU篩選水平有重要意義，借此，本文將選取135例PKU患兒進行臨床實驗，探討PAH突變檢測在PKU診斷中的價值和對PKU患兒的影響。現(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 按中華人民共和國衛(wèi)生部制定的《苯丙酮尿癥和先天性甲狀腺功能減低癥診治技術規(guī)范[衛(wèi)婦社發(fā)(96)號][6]本院2013年1月至2019年1月收治的PKU患兒135例進行回顧性實驗，納入標準：(1)符合上述納入標準者；(2)臨床檢測時血清PAH濃度≥360 μmol/L者；(3)年齡≤12歲者；(4)除PKU外無其他疾病者；(5)家屬簽署《知情同意書》和自愿參與本次實驗及臨床資料完整者。排除標準：(1)治療期間死亡，放棄治療及失訪者；(2)合并患先天性、神經(jīng)性、器質性疾病者。

1.2 方法

1.2.1 PKU篩查、診斷及分型 (1)全血DNA提?。核惺茉囌呷朐汉缶?jīng)本院檢驗科專業(yè)人員抽取PKU患兒的適量肘靜脈血并提取(血卡快速酚/三氯甲烷抽提法)其全血DNA(N P-968型核酸自動提取儀，生產(chǎn)單位：西安天隆科技有限公司)，具體的全血DNA操作步驟均嚴格按照Ex-DNA全血二代DNA提取試劑盒(西安天隆科技有限公司提供)相關步驟執(zhí)行。(2)診斷[7]：輕度PKU:360 μmol/L<血PAH濃度<1 200 μmol/L，經(jīng)典型PKU:血PAH濃度≥1 200 μmol/L。(3)基因分型：本次實驗中的PAH基因分型均采用SNaPShot基因分型技術(南京醫(yī)科大學附屬蘇州醫(yī)院生殖與遺傳中心實驗室建立)進行分型檢測，具體操作步驟均、反應條件均按文獻[8]報道執(zhí)行。具體操作：一是獲取基因后按實驗操作進行聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術處理并采用多重連接探針擴增技術(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)擴增與提純；二是對擴增后的標本進行SNaPShot延伸標志反應處理后再次提純，最后對標本實施毛細管電泳處理。而對SNaPShot分型處理不能準確獲取的PAH基因(患兒及其父親、母親)則再次采用其他(NGS技術)技術進行處理。(4)Sanger測序驗證：將上述步驟操作，尤其是SNaPShot和NGS分型處理后的PAH基因分型納入Sanger測序驗證。

1.2.2 治療與隨訪 (1)治療：本次所納入的受試者均結合其PAH濃度科學、合理的補助低PHE特殊食品低苯丙氨酸(2個月以內需50～70 mg·kg-1·d-1，3～6個月約40 mg·kg-1·d-1，2歲為25～30 mg·kg-1·d-1，4歲以上10～30 mg·kg-1·d-1，能維持血中苯丙氨酸濃度在0.12～0.6 mmol/L(2～10 mg/dL)為宜，持續(xù)干預1年食品喂養(yǎng)的基礎上，輔以母乳和牛奶干預。所有受試者診斷時間均為新生兒喂奶3 d后或入院后采集其足跟末梢血進行檢測，確診之日起開始進行飲食或藥物干預，干預時間。(2)隨訪：隨訪1年，1年后由兒童保健科的3名醫(yī)生負責，并做好各項數(shù)據(jù)記錄、整理、分析與存檔。

1.3 評價標準 所有患兒的智商(intelligence quotient，IQ)均采用中文版的《學齡前期智力量表》[9]對PKU患兒的言語智商(verbal intelligence quotient，VIQ)、操作智商(performance intelligence quotient，PIQ)及全智商(full intelligence quotient，F(xiàn)IQ)進行評定，即將Z的0分增值至100分，Z=15(每個Z的增值)，其中離差智商=100+15Z，上述三項指標中每項滿分100分，得分越高智商越好。PA、IQ檢測時間包括入院確診后和持續(xù)干預1年后兩個時間點。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用配對t檢驗和Pearson相關分析。

2 結果

2.1 SNaPShot基因分型檢測及Sanger測序驗證與檢測效果 經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，本文所納入的135例PKU患兒(270對PAH等位基因)中，男70例，女65例，年齡0～10歲，治療時長0.5～1.0年，所有患兒基線資料與基礎治療方案無明顯差異(P>0.05)，其中共有12例患兒有PAH基因突變，占比8.89%，突變位點共12個，其中R243Q、Y204C、R241C、IVS4-1、R413P、R111X、R261Q、W326X及Y356X等均有突變頻率，各占總PAH等位基因的5.19%、5.19%、3.70%、2.96%、2.22%、1.48%和1.48%、0.74%、0.74%，而E56D、F161S、A345T等則不發(fā)生突變(見表1)。

表1 SNaPShot檢測及Sanger測序對12例PAH基因突變的PKU患兒在國內常見12個突變位點基因型分布檢測結果

2.2 12例PAH基因突變患兒的家庭的家系基因診斷結果 經(jīng)SNaPShot、Sanger及MLPA檢測12例PKU患兒的PAH基因突變情況來看，純合突變2例，占比16.67%(2/12)，而復合、雜合突變10例，占比83.33%(10/12)(見表2)。

表2 SNaPShot、Sanger及MLPA檢測對12例PKU患兒的家系基因診斷情況統(tǒng)計表

2.3 12例PAH基因突變的PKU患兒臨床干預前后的血清PA水平及IQ測定 12例PKU患兒干預后的PA低于干預前、FIQ評分高于干預前，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而VIQ、PIQ干預前后差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3 12例PAH基因突變的PKU患兒臨床干預前后的血清PA水平及IQ測定

2.4 12例PAH基因突變的PKU患兒的PHE平均控制濃度與1周歲時的IQ檢測值 經(jīng)Pearson分析發(fā)現(xiàn)，12例PAH基因突變的PKU患兒治療期的PAH平均控制濃度與1周歲時的IQ檢測值呈負相關(r=-0.924，P<0.01)(見表4)。

表4 12例PAH基因突變的PKU患兒的PAH平均控制濃度與1周歲時的IQ檢測值相關性分析

3 討論

PKU的發(fā)病人群較為廣泛，成人、兒童乃至嬰幼兒都可能患病。既往研究[10～11]證實，PKU預后效果的好壞與飲食干預、治療依從性、PAH平均控制濃度等均有極大關系。對于PKU患兒而言，其神經(jīng)系統(tǒng)病變的發(fā)生多在其出生后1個月左右逐漸出現(xiàn)。正因如此，臨床上依舊將早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療作為預防和治療該病的基本原則。有學者[12]通過新生兒疾病篩查診斷并實施早期治療的大多數(shù)兒科疾病病人中，雖然大部分患兒的體質量指數(shù)(BMI)、體格及智力發(fā)育與正常兒童均相對接近，但PKU患兒的IQ與其他兒科疾病患兒的IQ相比卻相對較低。PKU發(fā)展及預后均有可能影響PKU患兒的智力發(fā)育，而PAH基因突變作為導致PKU的主要病因之一，對其進行檢測無疑十分必要。

據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫納入的相關數(shù)據(jù)顯示，截至2017年4月，該數(shù)據(jù)庫中收錄的PAH基因中有突變點的基因就達610種，在這些突變基因中相對常見的是錯義突變，而占比最大的應屬外顯子7突變，占比約16.0%。而結合目前國內研究結果表明，我國的PAH基因突變類型中，第6、7、12號外顯子極常見與多發(fā)[13]。而朱海燕等[14]的研究則證實，在這些PAH突變基因中，其突變率由高到低的分別是R243Q、IVS5-96A>G、R111X等，除此之外，包括外顯子7在內的基因突變情況也相對集中。由此可見，PAH基因突變是導致PKU的主要致病因素已成為不爭的事實。近年來，雖然臨床醫(yī)學在PAH基因突變研究方面已取得較好的臨床研究成績，但其突變研究大多集中于PAH基因編碼序列、內含子或內含子與外顯子交界區(qū)，而忽視了對PAH基因調節(jié)區(qū)的研究。如ROSS等[15]指出，肝細胞核因子-1(hepatic nuclear factor-1，HNF-1)作為機體中的一種重要的轉錄因子，其在PAH基因表達調控過程中扮演重要角色，值得注意的是，HNF-1與PAH基因的結合位點主要集中于PAH基因5′側翼。而有學者[16]也在其研究中發(fā)現(xiàn)，HNF-1在PAH基因表達中存在時間的長短及所扮演的促進PAH基因表達角色的好壞還與肝細胞二聚化因子(Dimerization cofactor of hepatocyte，DcoH)密切相關。當然近年來的研究再次證實PAH基因5′調控去中有3 700 bp缺失跡象[17]。以上研究均說明，PKU的發(fā)生不僅與PAH基因突變有關，也引起PAH基因調節(jié)區(qū)發(fā)生突變。

本文中，通過對135例PKU患兒的研究后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生PAH基因突變者共12例(8.89%)，突變位點共12個，其中R243Q、Y204C、R241C、IVS4-1、R413P、R111X、R261Q、W326X及Y356X等9個突變點的突變頻率各占總PAH等位基因的5.19%、5.19%、3.70%、2.96%、2.22%、1.48%、1.48%、0.74%、0.74%，而E56D、F161S、A345T等后三個突變點的突變頻率在本文中則不顯著，這與王本敬等[18]的研究結果相近。而本文中的SNaPShot、Sanger及MLPA檢測結果也發(fā)現(xiàn)，在12例PKU患兒的PAH基因突變中純合突變率僅16.67%，復合、雜合突變則高達83.33%。而經(jīng)過家系基因診斷來看，這12例PAH基因突變患兒的上述基因突變基本上均來自父母親雙方，而單純來源于父親或母親的概率則極低。文獻[19]研究發(fā)現(xiàn)，在SNaPShot檢測中的上述12種PAH基因突變類型，無論是純合突變，還是其他(復合、雜合)突變都是導致PKU的主要致病因素。這再次證實PAH基因突變是導致PKU的主要因素。那么PAH基因突變與PKU患兒的智力發(fā)育是否有關呢？許靜等[20]研究發(fā)現(xiàn)，PAH水平在干預后與PKU患兒的VIQ、PIQ、FIQ均無顯著相關性，但PAH的波動情況與患兒的FIQ則呈負相關(r=-0.78，P<0.05)，而本文中的Pearson分析發(fā)現(xiàn)，隨著PAH平均控制濃度的逐漸降低，IQ檢測值則逐漸遞增，PKU患兒治療期的PHE平均控制濃度與1周歲時的IQ呈負相關(P<0.05)。本文與上述研究均有相似之處，當然也有不同之處，這在于許靜等未對PKU患兒的預后情況進行跟蹤隨訪，而本文則對12例PAH基因突變患兒進行了為期1年的隨訪。同時在本文中還發(fā)現(xiàn)，12例PKU患兒干預后的PA低于干預前、FIQ評分高于干預前(P<0.05)，而VIQ、PIQ干預前后均無顯著差異(P>0.05)。可見結合PKU患兒PAH基因突變情況科學、合理、嚴格的控制PAH血濃度對提升PKU患兒的IQ有一定的促進效能。而吳志君[21]研究15例PKU患兒后發(fā)現(xiàn)，在對血PAH平均濃度行科學、合理的控制后，80.0%(12/15)PKU患兒的IQ均有所改善，且有33.3%(5/15)的PKU患兒的IQ改善與健康兒童相比無差異。而在該研究中，當將血PHE平均濃度控制在(3.26±1.64)mg/dL時，PKU患兒整體的IQ值≥90。綜上，在準確掌握PAH基因突變的前提下，科學、合理地控制PAH水平對改善PKU患兒的IQ有一定的幫助。PAH基因突變與IQ的相互作用主要體現(xiàn)在以下幾個方面：一是PA在轉化為酪氨酸的過程中除了需要PAH外，還必須要有輔酶四氫生物蝶呤(Tetrahydrobiopterin，BH4)的參與，而當PAH發(fā)生基因突變時，則會導致包括BH4在內的相關酶的活性缺陷，最終導致PA無法正常轉化成酪氨酸而致使血液、腦脊液及相關組織中堆積PA；二是PA代謝為酪氨酸的通路受阻，相關的旁路代謝則會增強[21]，而當PA經(jīng)肝臟代謝時會產(chǎn)生大量的有害代謝物，繼而導致腦損傷。三是PKU的典型癥狀是生長發(fā)育和精神發(fā)育遲緩。臨床實驗[22]表明，隨著輔食劑量的不斷添加，對PKU患兒的智力發(fā)育越不利，而智力發(fā)育落后又會隨著大腦的逐漸成熟而日趨穩(wěn)定，其根源可能與父母雙方是致病基因變異的攜帶者有關。但更深層的研究仍有待更多的研究數(shù)據(jù)佐證。

綜上所述，在PKU病人的臨床治療過程中科學、合理地進行PAH基因突變檢測并嚴格控制患兒的PAH血濃度有較好的臨床應用與推廣價值，也是改善患兒IQ的關鍵因素之一，家長、醫(yī)學界和社會各界應高度重視。但就本研究情況來看，雖然在探析PAH基因突變的類型方面做了對照分析，對PAH基因突變與PKU患兒IQ的關系進行了比較研究，而證實了PAH基因突變對患兒的IQ水平指標也存在一定的影響，但對其他水平的影響還待進一步研究，故期待在未來的日子里有機會予以彌補。