趙艷麗，劉 釗，張家新，王人顥，劉志毅，田子路，劉 斌

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，到2030年，我國的女性乳腺癌發(fā)病人數(shù)預(yù)計(jì)達(dá)到23.4萬，而因患乳腺癌致死的人數(shù)將達(dá)到7萬人以上[1]。據(jù)2019年美國癌癥協(xié)會的最新報(bào)道稱，乳腺癌在女性惡性腫瘤中發(fā)病率仍為最高[2]，因此，對于尋找乳腺癌的特異分子指標(biāo)尤為重要。microRNA(miRNA)主要通過與靶基因結(jié)合抑制其表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及遷移侵襲能力[3]，由此miRNA受到人們的關(guān)注，同時(shí)也是對miRNA功能深入研究的開端[4-5]。目前在幾乎所有惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)miRNA的表達(dá)異常，認(rèn)為其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色[6]。miR-34基因最早被發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲中[7]，miR-34a可以靶向和調(diào)節(jié)Fra-1、LMTK3、Bcl-2、Notch等許多乳腺癌病人體內(nèi)的基因，提示miR-34a與乳腺癌的發(fā)病機(jī)制可能有關(guān)，miR-34a的失活或缺失可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。因此，研究miR-34a在乳腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理的關(guān)系，可以進(jìn)一步探討其臨床意義，為乳腺癌的預(yù)后及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 確診為乳腺癌并實(shí)施手術(shù)治療的67例病人的標(biāo)本組織，其中非浸潤性癌5例、浸潤性癌61例和特殊類型癌1例；根據(jù)2017年美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)第8版癌癥分期系統(tǒng)TNM 分期標(biāo)準(zhǔn)，臨床分期分為Ⅰ期24例，Ⅱ期32例，Ⅲ期10例，Ⅳ期1例。

1.2 技術(shù)路線 以確診為乳腺癌的67例病人的癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本為研究對象，應(yīng)用qRT-PCR檢測miR-34a的表達(dá)，最后檢測miR-34a與乳腺癌臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。

1.3 標(biāo)本收集 根據(jù)術(shù)前彩超結(jié)果，疑似乳腺癌者，取腫瘤組織以及相應(yīng)的距腫瘤邊緣5 cm以上的正常組織，放存液氮中，病理結(jié)果確診后，舍棄不能入組者，入組標(biāo)本置入-80 ℃冰箱凍存，同時(shí)記錄臨床資料備病理査詢和后續(xù)統(tǒng)計(jì)分析。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)病理明確診斷為乳腺癌；(2)臨床病理資料完整；(3)未合并其他惡性腫瘤；(4)術(shù)前未行新輔助化療、放療、內(nèi)分泌及靶向治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)手術(shù)病理非乳腺癌；(2)臨床病理資料不完整；(3)術(shù)前已經(jīng)行新輔助化療、放療、內(nèi)分泌及靶向治療。

1.4 方法 Trizol一步法提取RNA，用紫外線分光光度計(jì)測量RNA的純度，采取純度比率在1.8～2.0之間的樣本進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)。U6作為內(nèi)參對照，ΔCt=Ct(miR-34a)-Ct(U6)，ΔΔCt=ΔCt(乳腺癌)-ΔCt(正常組織),利用公式F=2-ΔΔCt計(jì)算得出組織中miR-34a的差異倍數(shù)。

三陰性乳腺癌判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)免疫組織化學(xué)的結(jié)果，癌組織免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果中雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和人類表皮生長因子受體(HER-2)均呈陰性的乳腺癌，其中HER-2陽性定義為免疫組織化學(xué)結(jié)果為3+或ISH檢測陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、Kruskal-WallisH檢驗(yàn)和配對設(shè)計(jì)的Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 乳腺組織中miR-34a的表達(dá) 比較2-△Ct癌和2-△Ct正常組織，其中ΔCt癌=[Ct(miR-34a)-Ct(U6snRNA)]癌，ΔCt正常組織=[(Ct(miR-34a)-Ct(U6snRNA)]正常組織，癌組織的中位數(shù)0.042，四分位間距0.024～0.095；正常組織的中位數(shù)為0.114，四分位間距0.058～0.155；乳腺癌組織中的miR-34a的表達(dá)量明顯低于相應(yīng)正常組織中的表達(dá)量(t=4.26，P<0.01)。

2.2 miR-34a的表達(dá)與臨床病理聯(lián)系 年齡、性別、月經(jīng)狀況、PR水平、Ki67表達(dá)與HER-2水平對病人癌組織miR-34a的表達(dá)影響均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);腫塊直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理類型、臨床分期、ER水平、是否三陰性對對病人癌組織miR-34a的表達(dá)影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～P<0.01)，腫塊直徑≤2 cm組的表達(dá)高于直徑>2 cm組(P<0.05)，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于有轉(zhuǎn)移組(P<0.05)，非浸潤性組的表達(dá)高于浸潤性(P<0.05)，Ⅰ期和Ⅱ期組的表達(dá)均高于Ⅲ+Ⅳ期組(P<0.01)，ER陽性組的表達(dá)高于陰性(P<0.01)，三陰性組的表達(dá)低于非三陰性組(P<0.01)(見表1)。

表1 miR-34a 表達(dá)與乳腺癌臨床病理參數(shù)之間關(guān)系[M，(P25～P75)]

續(xù)表1

3 討論

乳腺癌早期多表現(xiàn)為乳房腫塊、乳頭和乳暈改變，晚期癌細(xì)胞可發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，引起多器官病變，嚴(yán)重危害病人的身心健康，因此深入研究乳腺癌的分子機(jī)制，找到有效的檢測指標(biāo)，為治療提供依據(jù)，可以延緩病人的生命甚至達(dá)到治愈。近年隨著分子生物學(xué)研究的深入，越來越多的與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號分子被發(fā)現(xiàn)，研究報(bào)道幾種特定的 miRNA可以作為潛在的預(yù)測性生物標(biāo)志物[8]。腫瘤抑制因子p53是迄今發(fā)現(xiàn)與人類腫瘤相關(guān)性最高的基因，因此也一直作為研制抗癌藥的靶點(diǎn)[9]，腫瘤抑制因子p53可以直接調(diào)控miR-34a[10]，并且研究證明miR-34a是可以通過靶向調(diào)節(jié)與細(xì)胞周期停滯和凋亡相關(guān)的一系列基因，在決定細(xì)胞命運(yùn)中起關(guān)鍵作用[11]。因此，miR-34a可以作為一種新的生物指標(biāo)，為乳腺癌在臨床中的診斷及治療進(jìn)提供依據(jù)。

本研究中，miR-34a的表達(dá)與腫瘤病理分型、直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、ER及三陰性表達(dá)有關(guān)(P<0.05～P<0.01)，表明miR-34a的表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)，并且可作為一種新的生物標(biāo)志物，為乳腺癌的治療提供新的方案和依據(jù)，甚至是靶向治療提供分子基礎(chǔ)。miR-34a在男、女中表達(dá)出現(xiàn)明顯差異，但由于病例數(shù)少，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供實(shí)驗(yàn)思路，分析男性、女性乳腺癌病人中miR-34的表達(dá)情況，從而找出性別中表達(dá)差異，為乳腺癌的預(yù)防和治療提供幫助。