邵均均，高 威

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，其起病隱匿,確診時多已是晚期且預后較差[1]，大約90%的病例屬于上皮性卵巢癌，最常見的是高級別漿液性癌。與其他惡性腫瘤相同，上皮性卵巢癌的發(fā)生是一個將正常細胞推向惡性狀態(tài)的過程，可能涉及基因突變[2-3]。近年來較多研究指出BRCA1和BRCA2基因是卵巢癌的發(fā)病遺傳因素[4]。隨著近兩年卵巢癌維持治療的新探索，BRCA1/2基因檢測變得尤為重要，并且2020年NCCN指南中提出了完善BRCA1/2檢測將有益于卵巢癌整個一線治療模式的選擇。但病人的BRCA1/2基因狀態(tài)與病人的臨床病理特征有無密切的聯(lián)系，需要更進一步探索。本研究收集我院2018年1月至2019年1月就診的上皮性卵巢癌病人共70例進行BRCA1/2基因檢測，查看突變情況，并根據(jù)檢測結果將病人分為致病突變組和對照組，基于SPSS22.0分析2組病人的臨床病理特征有無差異?，F(xiàn)作報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病理確診為上皮性卵巢癌的病人70例，其中<50歲28例，≥50歲42例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期 31例，Ⅲ～Ⅳ期39例；病理類型：高級別漿液性乳頭狀癌44例，非高級別漿液性乳頭狀癌26例；具有家族遺傳性16例，無家族遺傳性54例；鉑敏感病人59例，鉑耐藥病人11 例。

1.2 主要試劑和儀器 人類BRCA1/2基因突變檢測試劑盒(HANDLE System)，DNA提取試劑盒(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司生產(chǎn))、Illumina測序試劑、普通 PCR 儀、磁力架、片段分析儀、凝膠電泳系統(tǒng)、核酸定量儀、掌上離心機、漩渦混合儀。

1.3 BRCA基因檢測方法

1.3.1 提取DNA 采取上皮性卵巢癌病人外周血2 mL，嚴格按照《DNA提取操作規(guī)程》進行DNA分離，分離完畢后按照Qubit.2.0 Fluorometer標準操作規(guī)程，對DNA樣本的dsDNA濃度進行檢測，并記錄濃度。

1.3.2 建庫 首先將引物(廈門艾德生物醫(yī)藥科技股份有限公司生產(chǎn))渦旋混勻，短暫離心，然后將PCR反應管置于PCR儀上進行擴增，PCR設置體積為50 μL，98 ℃ 30 s預變性，98 ℃ 10 s 變性，61 ℃ 10 s 退火，72 ℃ 20 s 延伸，25個循環(huán)，后72 ℃延伸 5 min ，4 ℃保存。最后運用磁力架對PCR產(chǎn)物進行純化。

1.3.3 上機測序 首先對純化后的文庫進行濃度質控和質量質控，然后使用illumina公司的Cartridge和Flow cell對文庫進行二代測序，使用廈門艾德生物信息分析系統(tǒng)對測序結果進行分析，得到BRCA1基因和BRCA2基因的突變結果，最后對測序結果進行人工復核。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用t′檢驗和χ2檢驗。

2 結果

2.1 上皮性卵巢癌病人BRCA1/2基因致病突變情況 70例上皮性卵巢癌病人中，出現(xiàn)BRCA1/2基因致病性突變的病人共計20例，總占比28.5%。BRCA1突變16例占22.85%(16/70)，BRCA2突變4例占5.71%(4/70)。其中移碼突變12例，無義突變8例。外顯子11突變8例占40%，在BRCA1中11號外顯子突變7例，其中2例為981-982位刪除AT后出現(xiàn)一個終止密碼子，翻譯終止(序號6)，2例1504-1508位刪除TTAAA后，502位的L(亮氨酸)突變?yōu)锳(丙氨酸)，并在突變位點之后2個氨基酸處終止翻譯(序號11)，1例2138位的C(半胱氨酸)突變?yōu)镚(丙氨酸)，并形成了終止密碼，翻譯終止(序號11)，2例為c.4801A>T的無義突變(序號14)。在BRCA2中11號外顯子突變1例，為4065-4068位刪除TACC后，1355位的N(天冬氨酸)突變?yōu)镵(賴氨酸)，并在突變位點之后10個氨基酸處終止翻譯(序號10)。臨床數(shù)據(jù)表明，在BRCA1/2突變的病人中，BRCA1基因中11號外顯子突變頻率較高，該外顯子或許是一個潛在的突變熱點區(qū)域。20種BRCA1、BRCA2基因致病突變情況見表1及圖1～4。

表1 20例上皮性卵巢癌病人BRCA1/2基因致病突變情況

2.2 BRCA1/2致病變異與未變異病人臨床病理特征的比較 研究結果發(fā)現(xiàn)BRCA1/2致病性突變組高級別漿液性乳頭狀癌發(fā)生率、對鉑類治療藥物敏感率、有家族史率均高于未突變組(P<0.05～P<0.01)，2組年齡和臨床分期比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

3 討論

1990年和1994年，研究者先后發(fā)現(xiàn)了2種與乳腺癌存在密切相關性的基因。這兩種基因，根據(jù)發(fā)現(xiàn)的先后，分別命名為乳腺癌1號和2號基因，即本文研究的BRCA1/2；2種基因均屬于抑癌基因，其編碼的蛋白通過同源重組通路參與DNA雙鏈損傷的修復，控制DNA損傷應答、調節(jié)DNA轉錄和染色體重組以誘發(fā)凋亡等方式從而抑制腫瘤[5-6]。當2種基因發(fā)生突變，它們會產(chǎn)生無效蛋白，導致細胞發(fā)生變性及惡化 。

在與此基因突變的相關人群當中，其罹患卵巢癌的風險明顯增加。正常婦女罹患卵巢癌的風險為1.4%，BRCA1基因突變攜帶者到70歲時發(fā)生卵巢癌的機率為40%～60%,BRCA2基因攜帶者的概率為10%～20%[7]。卵巢癌的傳統(tǒng)治療模式為手術、化療、復發(fā)、再治療、再復發(fā)，最后多線治療直至病人死亡。超過80%的晚期卵巢癌病人在經(jīng)過一線治療后會復發(fā)，且每次復發(fā)后，病人的疾病無進展生存時間(progression-free survival，PFS)會不斷縮短[8]。卵巢癌病人復發(fā)與鉑耐藥密切相關，化療緩解至復發(fā)的時間越長，再次鉑化療反應率越高[9]。人們在能否延長無鉑間期的問題上付出了較多努力，并且提出了癌癥的維持治療[10]。所謂的維持治療，主要是指癌癥病人在通過合理的方式，接受初始治療以后，相關的癥狀已經(jīng)得到一定程度的緩解，但是為了能夠進一步抑制其日后復發(fā)，而采取的系列維持治療[11-12]。

經(jīng)過長期的探索及實驗，PARP抑制劑翻開了卵巢癌維持治療的新篇章。奧拉帕利是全球第一個獲批上市的PARP抑制劑[13]，著名兩大Ⅲ期臨床實驗SOLO1[14]、SOLO2[15]，發(fā)現(xiàn)奧拉帕利作為一線及二線維持治療藥物可明顯延長BRCA突變的初治及鉑敏感復發(fā)卵巢癌病人的PFS，降低疾病進展或死亡風險。這兩項著名研究的提出為卵巢癌病人的治療提供了新的方向，但是也指出了PARP抑制劑的準確受益人群依賴BRCA基因檢測。PARP抑制劑對BRCA基因突變的上皮性卵巢癌病人表現(xiàn)出了顯著的效果，并在2020年NCCN指南中提出了完善BRCA檢測將有宜于卵巢癌整個一線治療模式的選擇。

本研究選擇蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院自2018年1月至2019年1月收治經(jīng)手術確診的70例上皮性卵巢癌病人，通過二代測序方法，對每個病人進行BRCA1/2基因檢測，了解相關的突變情況。探究病人是否在年齡、臨床分期、病理類型、家族遺傳性、鉑敏感性之間有相關性。結果顯示上皮性卵巢癌病人中，BRCA1/2突變占有較高比例，占28.5%，其中BRCA1 16例，BRCA2 4例，提示了對BRCA1/2基因檢測可評估罹患卵巢癌風險程度。ROY等[16]指出，BRCA1/2為乳腺癌的易感基因，其最常見的突變類型是無義突變和移碼突變，而且會以常染色體顯性遺傳的方式傳給子代；本研究中，20例卵巢癌致病突變病人移碼突變12例，無義突變8例，與之研究結果一致。HALL等[17]指出，BRCA1/2在不同人種間突變率及突變位點具有明顯差異，本研究中外顯子11突變8例，突變率較高占40%，說明11號外顯子可能為卵巢癌BRCA1/2基因突變的突變熱點。有研究[18]指出，BRCA基因突變的卵巢癌病人普遍比未突變病人年輕，并且與種族有關，猶太女性BRCA突變的可能性是普通人群的10倍。在本研究中，BRCA1/2突變組的年齡普遍低于未突變組，但差異并無統(tǒng)計學意義。YOU等[19]對172例中國上皮性卵巢癌病人的BRCA1/2突變進行檢測，研究了BRCA突變狀態(tài)對中國上皮性卵巢癌病人生存結果的影響。研究中表明與其他病理類型病人相比，高級別漿液性癌病人存在更多的致病性突變，本研究結果與之顯示一致，此項結果代表了BRCA1/2突變卵巢癌病人腫瘤的惡性程度及復發(fā)風險可能相對較高。但BRCA1/2突變的病人表現(xiàn)出了對鉑類藥物治療的敏感性，與PENNINGTON等[20]的研究結果相同，這一結果對卵巢癌的治療效果評價具有指導作用。另外BRCA1/2卵巢癌病人基因突變與否與病人家族史有關，基因突變的病人具有一定的家族遺傳性，通過BRCA檢測，能夠有效地篩查和評估病人的家族遺傳性突變情況。同時，可以對病人家屬的卵巢癌的患病風險情況進行評估。隨著針對BRCA基因突變病人治療方法的出現(xiàn)，精準治療會越來越普及，對所有患有高級別漿液性卵巢癌病人進行基因檢測，該人群的治療效果將會有所改善，因此，了解BRCA狀況有助于為治療決策提供依據(jù)。