夏澤亮，劉言玉，褚 亮，劉言浩，王法寶，周超毅，蔣 磊

膽囊癌是一種發(fā)生在膽囊組織的惡性腫瘤，其發(fā)病率在我國消化道腫瘤高居第五[1]。膽囊癌早期臨床癥狀不明顯，診斷困難，且由于其惡性程度高、病情發(fā)展迅速、預后差等特點，使膽囊癌病人的死亡率較高，五年生存率不足5%[2-3]。近年黏蛋白(mucin，MUC)對于腫瘤的影響逐漸得到學術界的重視[4]。MUC是一種通過上皮細胞分泌，具有單次跨膜結構的高度糖基化蛋白，在信號轉導通路、免疫應答等生理病理過程中均具有一定調(diào)控作用[5]。MUC16基因位于染色體19p13.2位點，是卵巢癌的特異性診斷標志物之一。但當前關于膽囊癌細胞與MUC16間相互作用的研究仍不深入。本文采用RNA干擾技術觀察MUC16對人膽囊癌細胞GBC-SD增殖和遷移的影響，探討其可能的作用機制，以期為后續(xù)研究提供參考?，F(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人膽囊癌GBC-SD細胞(中科院上海分院細胞所細胞庫)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國GIBICO公司)；pGMLV-SC1 RNAi慢病毒載體(上海前塵生物公司)；PCR試劑primer(生工生物工程上海有限公司)；Matrigel膠(美國BD公司)；96孔板和CCK-8(美國Corning公司)；奧林巴斯IX71/81型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與處理 采用慢病毒感染GBC-SD細胞中MUC16(GBC-SD+MUC16-siRNA組)，同時設立陰性對照組(GBC-SD+NC組)及空白對照組(GBC-SD組)。采用RT-PCR、Western blotting法鑒定siRNA MUC16基因沉默效果，采用Western blotting法檢測GBC-SD細胞中增殖細胞核抗原(PCNA)和CD44蛋白表達情況。

1.2.2 RT-PCR 引物由上海生物工程科技有限公司合成，根據(jù)基因庫，設計并合成3個siRNA質(zhì)粒沉默膽囊癌細胞GBC-SD。插入序列如下：MUC16siRNA1：AAA GCC ACA TCA CCA ATG TTT；MUC16siRNA2：ACA GCA GCA TCA AGA GTT ATT；MUC16siRNA3：AAA CCT CAC CAT CTG TAA CTT；對照序列為GGA ATC TCA TTC GAT GCA TAC。抽提總RNA，逆轉錄cDNA后進行RT-PCR對數(shù)據(jù)進行分析，siRNA1、siRNA2和siRNA3的相對表達水平分別為0.74±0.15、0.59±0.11和0.41±0.24，其中siRNA3當選為最高效序列，遂進行后續(xù)實驗。

1.2.3 噻唑藍實驗檢測GBC-SD細胞增殖情況 GBC-SD細胞經(jīng)48 h培養(yǎng)后，取出培養(yǎng)板，加入DMEM培養(yǎng)液150 μL，避光孵育4 h后吸取100 μL培養(yǎng)液與150 μL二甲亞砜溶液振蕩10 min。擱至紫色結晶物完全融解，使用酶標儀在570 nm波長下測得每孔吸光度(重復測量3次后取平均值)A值，設定GBC-SD組中的細胞活力為100%，計算各組細胞增殖率。細胞增殖率=(實驗組A值-空白孔組A值)/(對照組A值-空白孔組A值)×100%。

1.2.4 劃痕實驗檢測GBC-SD遷移能力 采用胎牛血清(10%)培養(yǎng)基配制單細胞懸液，接種于96孔板(每孔5×105個細胞)后培養(yǎng)24 h。待細胞密度達到80%，以200 μL滅菌槍頭劃線，使用PBS將劃痕內(nèi)殘存細胞洗凈后轉入空白培養(yǎng)基，使用電子顯微鏡于0 h和48 h拍照并觀察遷移細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用方差分析和LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 RT-PCR檢測MUC16 mRNA表達 GBC-SD+MUC16-siRNA組MUC16 mRNA表達水平均明顯低于GBC-SD組和GBC-SD+NC組(P<0.01)，GBC-SD+NC組和GBC-SD組MUC16 mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 3組細胞中MUC16 mRNA相對表達水平比較

2.2 噻唑藍實驗檢測GBC-SD細胞增殖情況 GBC-SD+MUC16-siRNA組細胞增殖率低于GBC-SD組(P<0.05)，而GBC-SD+MUC16-siRNA組、GBC-SD組和GBC-SD+NC組細胞增殖率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 3組GBC-SD細胞增殖率比較

2.3 劃痕實驗檢測GBC-SD細胞遷移能力 培養(yǎng)48 h后，GBC-SD+MUC16-siRNA組GBC-SD細胞遷移數(shù)均低于GBC-SD組和GBC-SD+NC組(P<0.05)，GBC-SD+NC組與GBC-SD組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見圖1、表3)。

表3 3組GBC-SD細胞遷移數(shù)目比較

2.4 Western blotting檢測GBC-SD細胞中MUC16、PCNA、CD44蛋白表達 GBC-SD+MUC16-siRNA組MUC16、CD44蛋白表達均低于GBC-SD組、GBC-SD+NC組(P<0.05～P<0.01)，PCNA蛋白表達亦低于GBC-SD+NC組(P<0.05)，GBC-SD組和GBC-SD+NC組MUC16、PCNA、CD44蛋白表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表4、圖2)。

表4 3組MUC16、PCNA、CD44蛋白表達比較

3 討論

膽囊癌屬于高惡性程度消化道腫瘤，發(fā)病率、死亡率高。調(diào)查[5]顯示，我國膽囊癌病人5年生存率不足5%，中位生存時間僅為半年。膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展影響因素較多，但具體機制尚不明確。本文采用RNA干擾技術對MUC16對人膽囊癌細胞GBC-SD增殖、遷移的影響以及可能作用機制進行探討。

近年發(fā)現(xiàn)MUC在癌變細胞中多存在表達異?，F(xiàn)象。研究[6]表明，MUC16在正常卵巢上皮細胞中基本不表達，但卵巢癌細胞有異常的高表達現(xiàn)象，基于此項特點廣泛應用于卵巢癌的早期診斷。近期還有研究指出MUC16與胃癌[7]、肝外膽管癌[8]的發(fā)生發(fā)展也有密切的關系。國外研究[9]顯示，MUC16在人體正常肝臟組織和肝內(nèi)膽管組織不表達，但在肝外膽管癌細胞中有高表達現(xiàn)象，提示MUC16很可能與肝膽癌變有關。段海章等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)MUC16的陽性表達可能促進膽囊癌的發(fā)生發(fā)展，具有成為膽囊癌腫瘤標志物的可能性，并且可以在一定程度上預示膽囊癌的惡性及浸潤程度[12-13]。

PCNA是一種真核細胞DNA合成必需的核蛋白，通過影響DNA聚合酶參與調(diào)節(jié)DNA合成，與細胞的增殖周期密切相關[14]。研究[15]顯示，PCNA可以促進腫瘤細胞的快速增殖，參與腫瘤組織的浸潤與轉移，其表達量與腫瘤細胞增殖及分化能力密切相關。PCNA還可在缺氧狀態(tài)下間接促進腫瘤病灶血管生成。因此，PCNA陽性表達程度是評估腫瘤細胞增殖狀態(tài)和評價腫瘤惡性潛能的重要指標[16]。本研究顯示，沉默MUC16能夠下調(diào)細胞中PCNA表達，推測膽囊癌細胞增殖與此有一定關聯(lián)。

CD44是一種表面跨膜糖蛋白，也是一種表面黏附分子，廣泛參與細胞間、細胞與胞外基質(zhì)之間的特異性黏附過程[17]。近年有研究[18]顯示，CD44在三陰性乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中出現(xiàn)了異常的高表達，并參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤轉移。本課題組發(fā)現(xiàn)沉默MUC16可下調(diào)人膽囊癌細胞CD44表達水平，推測膽囊癌細胞遷移與此有一定關聯(lián)。

綜上所述，siRNA沉默MUC16可顯著抑制膽囊癌細胞增殖與遷移，通過調(diào)控PCNA、CD44蛋白實驗，表明MUC16參與膽囊癌的發(fā)生發(fā)展，對膽囊癌的靶向治療有一定的參考價值，但MUC16參與膽囊癌的具體作用機制目前尚不清楚，是否還通過其他途徑發(fā)揮作用也有待進一步深入探討。