秦安敏，司應(yīng)明，付盈盈，劉思麗

卵巢癌是全球第二致命的婦科惡性腫瘤，也是導(dǎo)致女性癌癥相關(guān)死亡的第七大常見(jiàn)原因[1]。由于其發(fā)病隱匿，且缺乏有效可靠的診斷方法，大多數(shù)卵巢癌病人發(fā)展到晚期時(shí)才被發(fā)現(xiàn)，并且在原發(fā)性細(xì)胞減滅術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)的一線化療后再次發(fā)現(xiàn)病灶[2]。盡管治療手段在不斷的改進(jìn)和更新，但卵巢癌病人的生存率仍沒(méi)有明顯的提高[3]，所以需要探索更加有效的新的治療方法。中醫(yī)中藥在醫(yī)療保健系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，從中藥中篩選開(kāi)發(fā)抗腫瘤新藥是非常好的策略。二氫楊梅素存在于多種藤茶植物中，屬于黃酮類(lèi)化合物，文獻(xiàn)[4]報(bào)道其具有很好的調(diào)節(jié)血糖和血脂、調(diào)理免疫功能、抗氧化、保護(hù)肝臟、抗凋亡、抗癌等多方面的藥理活性[4]。而二氫楊梅素這些藥理作用的機(jī)制分別與調(diào)節(jié)包括葡萄糖代謝和TCA循環(huán)在內(nèi)的24種代謝途徑[5]、激活PI3K/Akt/FoxO3a信號(hào)通路[6]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)平衡以及肝細(xì)胞的死亡和再生[7]、MAPKs和PI3K/AKT介導(dǎo)的信號(hào)通路以及線粒體功能障礙[8]、TFEB通路介導(dǎo)的自噬[9]等有關(guān)。另外還發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素可通過(guò)影響MAPK/ERK通路而下調(diào)MAR1 mRNA和P-gp的表達(dá)，從而增強(qiáng)阿奇霉素的抗腫瘤作用[10]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為本研究奠定了基礎(chǔ)。本文則主要從對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路方面的影響探究二氫楊梅素對(duì)人卵巢癌HO-8910細(xì)胞的作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)二氫楊梅素提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要試劑及儀器 二氫楊梅素(購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)，批號(hào)MUST-13015108)，HPLC測(cè)得其質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99%；MTT(Amresco Inc公司)；CCK-8溶液(日本同仁化學(xué)研究所) ；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma公司)；膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(fluoresceineisothiocyanate,FITC )/碘化丙啶(propidium iodide,PI)雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)；Hoechst 33258染液(上海碧云天公司)；ERK、p-ERK、GAPDH、Bax、Bcl-2、caspase-3兔抗人單克隆抗體(美國(guó)CST公司)；371型CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher公司)；MK3型酶標(biāo)儀(美國(guó)THERMO公司)；IX73倒置顯微鏡(Olympus公司)；BSA124S電子天平(美國(guó)Sartorius公司)；FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)復(fù)蘇人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910(購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛公司)，加入補(bǔ)充了10%FBS以及100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，按細(xì)胞提供者規(guī)定的條件將細(xì)胞于37 ℃、含有5%CO2恒溫潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞繁殖至整個(gè)培養(yǎng)皿表面的80%時(shí)，用2.5 g/L的胰酶進(jìn)行消化和傳代，并用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖率 取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)優(yōu)良的HO-8910細(xì)胞，常規(guī)處理后用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整成5×104個(gè)/毫升密度的細(xì)胞懸浮液，每孔100 μL加入96孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至60%后隨機(jī)分組，給藥組分別加入不同濃度二氫楊梅素溶液(終濃度分別為10、20、40 μmol/L)，細(xì)胞對(duì)照組加入等量培養(yǎng)液，每個(gè)組平行6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，移棄上清液，PBS清洗各孔后加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h再次更換上清液為DMSO溶液100 μL，搖床上震蕩使紫色結(jié)晶溶解均勻，將酶標(biāo)儀設(shè)置波長(zhǎng)為490 nm，以空白對(duì)照孔調(diào)零，檢測(cè)各孔吸光度(OD)值，OD值越高代表細(xì)胞數(shù)量越多。并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(空白組OD-藥物組OD)/空白組OD]×100%。

1.2.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO-8910細(xì)胞，加入RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整成5×104個(gè)/毫升的單細(xì)胞懸液加入96孔板，每孔100 μL，恒溫恒濕培養(yǎng)24 h后將所有孔隨機(jī)分為7組，藥物組分別加入不同濃度二氫楊梅素(終濃度分別為10、20、40 μmol/L)，空白對(duì)照組加入等量培養(yǎng)基，每組平行6個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)48 h后各孔加入CCK-8工作液10 μL混勻，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，結(jié)合試劑盒說(shuō)明書(shū)記錄酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處的OD值，同上公式計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4 Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 同上述方法將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO-8910細(xì)胞制成密度為1×106個(gè)/毫升的細(xì)胞懸液，充分吹打使分散均勻后接種于6孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分組，用10、20、40 μmol/L的二氫楊梅素處理細(xì)胞另設(shè)不加藥的空白對(duì)照，每組3個(gè)平行孔，48 h后取出用胰酶消化，PBS清洗后加入300 μL的Binding緩沖液懸浮細(xì)胞，加入Annexin V-FITC 5 μL、 PI染色液5 μL輕柔混勻避光反應(yīng)，最后通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.2.5 Hoechst 33258熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按照1.2.4方法將接種、培養(yǎng)、分組并用相應(yīng)藥物作用HO-8910細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，吸出上清舊培養(yǎng)液后用PBS進(jìn)行清洗，各孔均加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗滌2次，并用10%BSA溶液封閉10 min，再次用PBS洗滌后，每孔用0.5 mL Hoechst 33258 室溫避光染色 15 min，吸凈表面染色液，用PBS輕輕漂洗2次后封片，于熒光顯微鏡下進(jìn)行對(duì)比觀察，正常細(xì)胞染色質(zhì)分布均勻，核被染成的藍(lán)色呈均勻狀態(tài)；核呈濃縮、碎裂的明亮藍(lán)色細(xì)胞則是凋亡細(xì)胞，隨機(jī)選取視野拍片，保持曝光度和對(duì)比度一致。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白和通路蛋白含量 按照1.2.4方法將接種、培養(yǎng)、分組并分別加入相應(yīng)藥物作用HO-8910細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，去除培養(yǎng)液并收集細(xì)胞，加入含蛋白酶抑制劑的RIRA裂解液100 μL吹打均勻，置冰上裂解細(xì)胞30 min，4 ℃ 14 000 r/min離心10 min提取上清總蛋白，每管取15 μg總蛋白加入上樣緩沖液煮沸5 min，行10%SDS-PAGE(55 V 30 min，95 V 90 min)凝膠電泳分離蛋白，后25 V恒壓下轉(zhuǎn)至 PVDF膜25 min；37 ℃ 5%脫脂牛奶中封閉1 h。加入一抗(Caspase-3、Bcl-2、Bax、ERK、p-ERK、β-actin，稀釋度均為1∶1 000)溶液4 ℃過(guò)夜，洗膜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液，37 ℃振搖1 h。PBS溶液振搖洗膜3次，采用二氨基聯(lián)苯胺發(fā)光顯影液顯色，以GAPDH為參比，采用 Image Pro Plus 6.0軟件分析目標(biāo)條帶的相對(duì)灰度值，計(jì)算各蛋白條帶與內(nèi)參照的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 二氫楊梅素對(duì)HO-8910細(xì)胞活性的影響 同時(shí)采用MTT和CCK-8法檢測(cè)二氫楊梅素對(duì)HO-8910細(xì)胞活性的影響，2種方法檢測(cè)的二氫楊梅素體外對(duì)HO-8910細(xì)胞活性的抑制作用趨勢(shì)一致，均隨著藥物濃度的增加而增高(P<0.01)，各組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與空白對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此可見(jiàn)二氫楊梅素體外可抑制HO-8910細(xì)胞的生長(zhǎng)，并具有濃度依賴(lài)性(見(jiàn)表1～2)。

表1 MTT法檢測(cè)二氫楊梅素對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖的抑制作用

表2 CCK-8法檢測(cè)二氫楊梅素對(duì)HO-8910細(xì)胞增殖的抑制作用

2.2 二氫楊梅素對(duì)HO-8910細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)10、20、40 μmol/L二氫楊梅素分別與HO-8910細(xì)胞共同作用48 h，結(jié)果顯示，各藥物組凋亡率均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)。且細(xì)胞凋亡率隨著二氫楊梅素濃度的升高而增加，具有濃度依賴(lài)性(見(jiàn)圖1、表3)。

表3 二氫楊梅素對(duì)HO-8910細(xì)胞凋亡的影響

2.3 二氫楊梅素對(duì)HO-8910細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響 不同濃度的二氫楊梅素與HO-8910細(xì)胞共同作用48 h后，熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡特征，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞質(zhì)逐漸濃縮，并發(fā)出明亮藍(lán)色熒光，這種變化隨著藥物濃度的增加愈發(fā)明顯；而空白對(duì)照組細(xì)胞則排列整齊，大小均一，表現(xiàn)為均勻的藍(lán)色(見(jiàn)圖2)。

2.4 二氫楊梅素對(duì)HO-8910細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 Western blotting結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，二氫楊梅素作用于HO-8910細(xì)胞后，隨濃度的增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)逐漸降低，促凋亡蛋白Bax和caspase-3表達(dá)則逐漸升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見(jiàn)圖3、表4)。

表4 二氫楊梅素對(duì)HO-8910細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

2.5 二氫楊梅素對(duì)細(xì)胞通路蛋白的影響 Western blotting結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，二氫楊梅素作用于HO-8910細(xì)胞后，通路蛋白ERK、p-ERK的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，提示二氫楊梅素可通過(guò)抑制MAPK/ERK通路來(lái)誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞凋亡(見(jiàn)圖4、表5)。

表5 二氫楊梅素對(duì)HO-8910細(xì)胞凋亡通路蛋白的影響

3 討論

二氫楊梅素是我國(guó)近些年來(lái)新開(kāi)發(fā)的一種黃酮醇類(lèi)黃酮化合物，在自然界植物中含量豐富。作為一種天然存在的產(chǎn)物，二氫楊梅素的藥用功效多而廣泛，可調(diào)節(jié)多條通路、影響多種機(jī)制,對(duì)多種腫瘤產(chǎn)生拮抗生長(zhǎng)的作用。卵巢癌是在女性中常見(jiàn)的、并且較難治愈的生殖系統(tǒng)疾病，且發(fā)病年齡逐漸趨向年輕。因腫瘤細(xì)胞自身可大量分泌生長(zhǎng)因子受體，直接導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)節(jié)制地受到增殖信號(hào)刺激，無(wú)限分裂增殖，而凋亡相對(duì)減少，所以對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制能力是評(píng)判抗腫瘤藥物有效率的首要標(biāo)準(zhǔn)[11]。本研究同時(shí)采用MTT和CCK-8兩種方法檢測(cè)二氫楊梅素對(duì)人卵巢癌HO-8910細(xì)胞體外增殖的影響，結(jié)果均表明隨著二氫楊梅素濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，即對(duì)HO-8910細(xì)胞的抑制作用逐漸增加。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素可明顯促進(jìn)HO-8910細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨濃度增大而增加。Hoechst 33258熒光染色檢測(cè)結(jié)果表明，空白對(duì)照組細(xì)胞排列整齊，大小均一，二氫楊梅素作用的HO-8910細(xì)胞則出現(xiàn)明顯的凋亡特征，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，呈強(qiáng)熒光反應(yīng)，隨著藥物濃度增加，細(xì)胞凋亡率明顯上升。以上結(jié)果均證明了二氫楊梅素通過(guò)誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞凋亡而抑制其生長(zhǎng)。

細(xì)胞凋亡是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的細(xì)胞生理性的自動(dòng)結(jié)束生命的過(guò)程，被精密控制，發(fā)生于胚胎發(fā)育、組織重建、免疫調(diào)節(jié)及腫瘤退化的各個(gè)階段[12]。只有當(dāng)?shù)蛲鰷p少，增殖和凋亡水平不再平衡，出現(xiàn)無(wú)限增殖的時(shí)候才形成腫瘤凋亡，所以凋亡逃逸即表明著癌癥的發(fā)生。凋亡的發(fā)生過(guò)程是在多種基因和多條信號(hào)通路共同參與下進(jìn)行，其中Caspase家族在整個(gè)過(guò)程中起著不可替代的作用[13]，尤其是作為細(xì)胞凋亡途徑中重要的執(zhí)行因子之一的Caspase-3，是多種凋亡蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。Bcl-2蛋白是與凋亡密切相關(guān)的Bcl-2家族中最關(guān)鍵的抗凋亡基因，定位于人染色體18q2113，可阻斷Caspase-3誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過(guò)程[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)，Bcl-2與細(xì)胞增殖存在著緊密聯(lián)系，如miR-371-5p基因可通過(guò)對(duì)Bcl-2的靶向作用而削減人鼻咽癌細(xì)胞無(wú)限增殖和進(jìn)行遷移的能力。Bax是與Bcl-2共沉淀的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，Bcl-2/Bax比值可影響線粒體釋放Cyt-C的能力，進(jìn)而影響下游Caspase的激活從而平衡調(diào)控細(xì)胞凋亡。本研究Western blotting結(jié)果顯示，二氫楊梅素能濃度依賴(lài)性地上調(diào)凋亡啟動(dòng)因子Caspase-3和促凋亡因子Bax，下調(diào)抑凋亡因子Bcl-2，這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了二氫楊梅素能夠誘導(dǎo)人卵巢癌HO-8910細(xì)胞的凋亡。

細(xì)胞的存活受增殖和凋亡比例的影響。絲裂原活化蛋白激酶/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(MAPK/ERK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過(guò)調(diào)節(jié)下游的基因蛋白參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、分裂、死亡等多種過(guò)程，在許多癌癥中均能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。ERK是一類(lèi)絲/蘇氨酸蛋白激酶，是MAPK家族眾多成員中最重要的環(huán)節(jié)，也是該通路中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)成分[16]。它位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，只有在信號(hào)刺激下磷酸化成p-ERK才能表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞分化、增殖、存活等多種環(huán)節(jié)進(jìn)行調(diào)節(jié)的活性，并分泌炎癥因子，產(chǎn)生各種效應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)的ERK家族中ERK1和ERK2是研究的較為清楚的[17]。在多種腫瘤中存在ERK的過(guò)度激活，其一面接收來(lái)自細(xì)胞外的激素、生長(zhǎng)因子以及環(huán)境刺激等信號(hào)被激活；一面又影響核轉(zhuǎn)錄因子AP-1、核轉(zhuǎn)錄因子-κB等的表達(dá)[18]，從而介導(dǎo)和放大腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程。我們發(fā)現(xiàn)不同濃度的二氫楊梅素與HO-8910細(xì)胞共同作用后，通路蛋白ERK、p-ERK的表達(dá)明顯降低，其降低程度與濃度增長(zhǎng)均成負(fù)相關(guān)，因此推測(cè)二氫楊梅素可能通過(guò)抑制ERK/ MAPK通路，從而抑制HO-8910細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素能通過(guò)調(diào)節(jié)ERK/MAPK通路、促進(jìn)關(guān)鍵蛋白Caspase-3和Bax的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，有效抑制人卵巢癌HO-8910細(xì)胞的生長(zhǎng)。而目前已有多項(xiàng)研究尋找有關(guān)制劑切斷ERK信號(hào)途徑以達(dá)到治療腫瘤的目的，結(jié)合本研究提示ERK/MAPK通路可能是卵巢癌治療的靶點(diǎn)，為卵巢癌的臨床治療提供了參考。