魏佳明，李 雅，郭志華，匡 琳，李 卉

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

慢性心力衰竭是一組以高發(fā)病率、高病死率為特點(diǎn)的臨床綜合征，且心力衰竭過(guò)程中伴隨著腎臟病理?yè)p傷，目前尚無(wú)特異性治療方法[1-3]。中醫(yī)藥治療具有整體觀念及多靶點(diǎn)、多途徑調(diào)控優(yōu)勢(shì)，治療該類患者療效逐漸得到認(rèn)可[4-5]，值得深入挖掘。益心泰是根據(jù)中醫(yī)理論創(chuàng)制的臨床科研方，前期研究已證實(shí)益心泰有效組分能提高心肌梗死后心力衰竭兔的心功能，改善心肌病理結(jié)構(gòu)[6]。本研究擬通過(guò)觀察益心泰有效組分對(duì)慢性心力衰竭兔血清心鈉素(ANP)水平、心臟超聲指標(biāo)及心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、腎臟病理結(jié)構(gòu)的影響，進(jìn)一步探究益心泰有效組分治療慢性心力衰竭的價(jià)值，為其臨床應(yīng)用提供更多實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重1.5～2.0 kg的普通級(jí)健康新西蘭兔120只，雌雄各半，購(gòu)自湖南太平生物科技有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(湘)2015-0004，合格證號(hào)：NO.43608300000615。兔分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水，光/暗周期12h/12h(光照時(shí)間6:00—18:00)，室溫23 ℃左右，濕度52%～60%，通風(fēng)。該實(shí)驗(yàn)得到湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)(LL2018010801)。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 益心泰有效組分：黃芪、丹參、紅花、豬苓、澤瀉購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，按照3∶1∶1.5∶1∶1配比，采用系統(tǒng)溶劑法與大孔樹脂吸附法相結(jié)合，對(duì)益心泰復(fù)方中4個(gè)不同極性部位的藥效組分進(jìn)行分離，根據(jù)最佳工藝條件，分離得到益心泰有效組分提取液，冷凍干燥得提取物(含總皂苷372.4 mg/g、總黃酮98.3 mg/g、總多糖445.8 mg/g)；氯沙坦鉀，杭州默沙東制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20000371，規(guī)格：50 mg/片；丙基硫氧嘧啶，蘇州東瑞制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H32020795，規(guī)格：50 mg/片；烏拉坦，Sigma，貨號(hào)：94300；生理鹽水，四川科倫藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H51021158，規(guī)格：500 mL/瓶。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 ANP ELISA檢測(cè)試劑盒(江萊生物，貨號(hào)：JL22215)；多聚甲醛(Sigma，貨號(hào)：16005)；蘇木精(Sigma，貨號(hào)：H9627)；伊紅(Sigma，貨號(hào)：E4009)；石蠟(河南天孚化工有限公司)；超聲心動(dòng)圖機(jī)(西門子公司，貨號(hào)：Sequoia 512)；RM2235石蠟輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(Leica公司)；電子秤(湘儀天平儀器設(shè)備有限公司)。

1.4實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)選擇健康兔20只作為正常對(duì)照組，其余100只以阿霉素耳緣靜脈注射+丙基硫氧嘧啶灌胃方法制作慢性心力衰竭模型：將兔固定于手術(shù)臺(tái)上，按照兔進(jìn)食量的0.2%予以丙基硫氧嘧啶灌胃，每日1次，并分別于每周三、周日下午耳緣靜脈注射濃度為1 mg/mL的阿霉素溶液1 mg/kg；正常對(duì)照組予等次等量的生理鹽水灌胃與耳緣靜脈注射。連續(xù)造模8周后，以兔心率及呼吸頻率升高，精神萎靡，抓起反抗下降，耳溫及尿量減少，伴有水腫表現(xiàn)，血清ANP水平及左心室收縮末期內(nèi)徑(LVIDs)、左心室舒張末期內(nèi)徑(LVIDd)顯著升高為造模成功。造模過(guò)程中共有16只兔死亡，均死于腹瀉。將造模成功的兔按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法分為模型組(17只)、益心泰有效組分低劑量組(17只)、益心泰有效組分中劑量組(17只)、益心泰有效組分高劑量組(17只)和氯沙坦鉀組(16只)，益心泰有效組分低、中、高劑量組分別給予2.1 g/(kg·d)、4.2 g/(kg·d)和8.4 g/(kg·d) (根據(jù)成人體表面積換算法，結(jié)合臨床用藥經(jīng)驗(yàn)和既往實(shí)驗(yàn)研究確定給藥劑量，相當(dāng)于臨床劑量的2,4,8倍)的益心泰有效組分灌胃，氯沙坦鉀組給予2.75 mg/(kg·d)的氯沙坦鉀懸液灌胃，正常對(duì)照組與模型組灌胃同等容積的蒸餾水，各組灌胃量均為每次10 mL/kg，均每日1次，連續(xù)4周。

1.5觀察指標(biāo)及方法

1.5.1一般情況 觀察各組兔毛色、精神狀態(tài)、心率、呼吸頻率、耳溫、尿量、水腫等一般情況。

1.5.2血清ANP水平 采用ELISA法檢測(cè)：灌胃結(jié)束后麻醉兔，心臟采血，靜置，離心，稀釋，過(guò)夜，洗滌。加入待測(cè)血清樣品，反復(fù)孵育，洗滌，最后每孔加入0.05 mL 2 mol/L H2SO4，終止反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的OD值并記錄。

1.5.3心臟超聲 麻醉滿意后將兔平臥位固定，運(yùn)用西門子Sequoia 512超聲心動(dòng)圖機(jī)(探頭頻率3～8 MHz)，于心前區(qū)取左室長(zhǎng)軸最大直徑處，M型超聲標(biāo)記室間隔和左室后壁收縮末期與舒張末期心內(nèi)膜位置，隨機(jī)軟件自動(dòng)計(jì)算兔LVIDs及 LVIDd，取5個(gè)心動(dòng)周期讀數(shù)平均值。

1.5.4心臟指數(shù)及腎臟指數(shù) 空氣栓塞法處死兔后，稱重記錄，開胸，取心臟、腎臟，洗盡血液，剪去殘余大血管，濾紙吸干后稱重記錄。按臟器指數(shù)=臟器重量/體重公式計(jì)算心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)。

1.5.5腎臟組織形態(tài)學(xué) 處死兔后，取部分腎臟組織，4%多聚甲醛固定組織并修整，經(jīng)梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋，制備切片(厚4～5 μm)，烤片，HE染色，光鏡觀察并采圖。

2 結(jié) 果

2.1各組兔一般情況 模型組兔精神狀態(tài)、心率、呼吸頻率、耳溫、尿量、水腫等一般情況沒(méi)有明顯改變，其中部分兔較前嚴(yán)重；益心泰有效組分低、中、高劑量組及氯沙坦鉀組上述情況逐漸較前好轉(zhuǎn)，其中益心泰有效組分中、高劑量組和氯沙坦鉀組改善更明顯。整個(gè)灌胃過(guò)程中，模型組和益心泰有效組分低劑量組各3只、益心泰有效組分中劑量組2只、益心泰有效組分高劑量組和氯沙坦鉀組各1只死亡，均死于腹瀉；正常對(duì)照組無(wú)兔死亡。

2.2各組兔血清ANP水平比較 正常對(duì)照組、模型組、益心泰有效組分低劑量組、益心泰有效組分中劑量組、益心泰有效組分高劑量組與氯沙坦鉀組血清ANP水平分別為(62.19±1.67)ng/mL、(155.40±4.16)ng/mL、(138.68±3.18)ng/mL、(126.98±3.09)ng/mL、(125.03±3.54)ng/mL、(124.69±3.26)ng/mL，模型組明顯高于正常對(duì)照組(P<0.05)，益心泰有效組分低、中、高劑量組與氯沙坦鉀組均明顯低于模型組(P均<0.05)，益心泰有效組分中、高劑量組和氯沙坦鉀組均明顯低于益心泰有效組分低劑量組(P均<0.05)，益心泰有效組分中、高劑量組與氯沙坦鉀組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

2.3各組兔心臟超聲指標(biāo)比較 模型組LVIDs、LVIDd均明顯高于正常對(duì)照組(P均<0.05)，益心泰有效組分低、中、高劑量組與氯沙坦鉀組均明顯低于模型組(P均<0.05)，益心泰有效組分中、高劑量組和氯沙坦鉀組均明顯低于益心泰有效組分低劑量組(P均<0.05)，益心泰有效組分中、高劑量組與氯沙坦鉀組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。 見表1。

表1 正常對(duì)照組和慢性心力衰竭各組兔心臟超聲指標(biāo)比較

2.4各組兔心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)比較 模型組心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)均明顯高于正常對(duì)照組(P均<0.05)，益心泰有效組分低、中、高劑量組與氯沙坦鉀組均明顯低于模型組(P均<0.05)，益心泰有效組分中、高劑量組和氯沙坦鉀組均明顯低于益心泰有效組分低劑量組(P均<0.05)，益心泰有效組分中、高劑量組與氯沙坦鉀組之間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常對(duì)照組和慢性心力衰竭各組兔心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)比較

2.5各組兔腎臟組織形態(tài)比較 正常對(duì)照組兔腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，未見病理改變；模型組兔腎小球體積增大、腫脹，腎小管上皮呈現(xiàn)空泡樣變、管腔變大，間質(zhì)水腫，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)；益心泰有效組分低、中、高劑量組和氯沙坦鉀組以上情況較模型組依次有不同程度的減輕。見圖1。

圖1 正常對(duì)照組和慢性心力衰竭各組兔腎臟組織形態(tài)(HE，×400)

3 討 論

慢性心力衰竭病程纏綿，“久病多虛”“久病多瘀”“久病及腎”。中醫(yī)認(rèn)為慢性心力衰竭的主要病機(jī)為氣虛、血瘀、水停，其病機(jī)與心腎二臟密切相關(guān)?！端貑?wèn)·靈蘭秘典論》指出：“心者，君主之官也，神明出焉……腎者，作強(qiáng)之官，技巧出焉?！毙臑殛?yáng)臟，腎為水臟，二者互相溝通滋養(yǎng)，“水火既濟(jì)”。若心腎陽(yáng)氣失于互資，則血瘀加重，水濕不化，飲邪內(nèi)停，導(dǎo)致心力衰竭。慢性心力衰竭以呼吸困難、水腫和乏力為主要臨床表現(xiàn)。腎為先天之本，元?dú)庵?，腎氣充盛才能發(fā)揮主司納氣作用，腎氣不固則呼吸困難，元?dú)獠蛔銊t憊懶乏力，腎主水功能失權(quán)則發(fā)為水腫。研究表明，基于“心腎相關(guān)”防治慢性心力衰竭理論詳實(shí)、療效可靠[7-9]。益心泰由黃芪、紅花、丹參、豬苓、澤瀉等藥物組成，方中以黃芪為君，善補(bǔ)氣升氣、利水消腫，為治療氣虛水腫尿少之要藥。丹參活血化瘀，澤瀉利水滲濕，共為臣藥。佐以紅花活血通經(jīng)、祛瘀止痛，豬苓利水消腫。諸藥配伍，共奏益氣活血利水之功。本方在處理陰陽(yáng)上，主要以溫補(bǔ)陽(yáng)氣為主；在處理氣血上，主要以補(bǔ)氣為主、活血為輔；在處理臟腑關(guān)系上，主要以治療腎、心兩臟為核心。前期研究證實(shí)益心泰可改善慢性心力衰竭兔超聲心動(dòng)圖指標(biāo)，可抑制心肌組織原癌基因C-Myc表達(dá)，改善心功能[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)選用阿霉素耳緣靜脈注射+丙基硫氧嘧啶灌胃法制備兔慢性心力衰竭模型，操作簡(jiǎn)便，易于表現(xiàn)出慢性心力衰竭的疾病特點(diǎn)，不過(guò)阿霉素具有導(dǎo)致腹瀉作用，可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)中兔大量死亡的原因，與文獻(xiàn)[12]研究結(jié)果一致。造模后，模型組兔血清ANP水平及LVIDs、LVIDd、心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)較正常對(duì)照組明顯升高，提示慢性心力衰竭兔心功能下降及心臟、腎臟發(fā)生病理性改變；與模型組比較，各給藥組血清ANP水平及LVIDs、LVIDd、心臟指數(shù)、腎臟指數(shù)明顯降低，說(shuō)明益心泰有效組分能提高慢性心力衰竭兔心功能，減輕心臟、腎臟的病理性損傷。

綜上，益心泰有效組分在改善慢性心力衰竭兔心功能的同時(shí)減輕了其腎臟病理結(jié)構(gòu)的損傷，在豐富了益心泰有效組分實(shí)驗(yàn)研究?jī)?nèi)容的同時(shí)，為從“心腎相關(guān)”角度闡釋益心泰的作用機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。