唐 強，尹 俠，朱路文，王艷霞，李宏玉，

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著居民生活水平的提高和生活節(jié)奏的加快，心血管病的患病率不斷上升[1]，已成為全世界主要的公共衛(wèi)生問題之一。心肌缺血是引發(fā)心血管疾病的首要誘因[2]，臨床中隨著直接經(jīng)皮冠狀動脈介入治療、溶栓治療的發(fā)展，盡早恢復(fù)缺血心肌的血流灌注能夠挽救缺血心肌，但再灌注引起的缺血再灌注損傷成為影響冠心病治療效果的一大難題[3-4]。因此，探討心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生機制以及預(yù)防方法具有重要意義。近年來研究證實，缺血再灌注損傷的嚴重程度與炎癥因子表達的高低有直接關(guān)系[2]。缺血預(yù)適應(yīng)是心肌保護的新概念，是迄今為止最有效的內(nèi)源性心肌缺血保護方法[5-6]。有研究表明，電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理能有效調(diào)控炎性因子的水平，進而發(fā)揮保護受損心肌組織的作用[7]。本實驗通過建立離體心肌缺血再灌注損傷動物模型，進一步探討了電針預(yù)處理內(nèi)關(guān)穴對缺血再灌注心肌的保護作用，以為臨床應(yīng)用提供參考。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 于黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心購入36只SPF級健康成年Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠，體重280～300 g，動物許可證號：SYXK(黑)2019002。飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度(22±2)℃，濕度(50±10)%，自然晝夜節(jié)律變化光照，采用國家標準大鼠生長繁殖飼料喂養(yǎng)，自由飲食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2主要實驗儀器 Langendorff離體心臟灌流實驗系統(tǒng)，江蘇賽昂斯生物技術(shù)有限公司；-80 ℃超低溫冰箱，日本Panasonic公司；華佗牌SDZ-Ⅱ型電針治療儀，蘇州醫(yī)療用品有限公司；WB凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD公司；一次性無菌針灸針，規(guī)格：0.20 mm×13 mm，北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。

1.3主要試劑 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)，美國Sigma公司；無水乙醇，天津市天力化學試劑公司；多聚甲醛，天津光科密歐有限公司；肝素鈉注射液，天津生物化學制藥有限公司，規(guī)格：1萬IU/mL；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體、白細胞介素-6(IL- 6)抗體，北京奧博森生物公司；BCA蛋白定量試劑盒、蛋白裂解液，上海Beyotine Biotechnology公司；預(yù)染蛋白分子量Marker，美國Thermo scientific公司；羊抗兔IgG-HRP，上海碧云天物技術(shù)公司。

1.4實驗方法

1.4.1造模前預(yù)處理 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和電針預(yù)處理組，每組12只。電針預(yù)處理組在造模前2周，參照《實驗針灸學》并結(jié)合動物比較解剖學方法定位取雙側(cè)“內(nèi)關(guān)穴”，在大鼠前肢內(nèi)側(cè)、腕橫紋正中上3 mm處進進針，針刺深度約5 mm，連接華佗牌SDZ-Ⅱ型電針治療儀進行刺激，選用連續(xù)波，頻率2 Hz，強度為1 mA，通電20 min，1次/d，持續(xù)干預(yù)2周。對照組與模型組在電針預(yù)處理組預(yù)處理干預(yù)的2周內(nèi)自由飼養(yǎng)。

1.4.2造模方法 手術(shù)前配置Krebs-Henseleit(K-H)液，具體方法：將13.79 g氯化鈉、0.70 g氯化鉀、0.33 g磷酸二氫鉀、0.51 g硫酸鎂、4.36 g葡萄糖、4.20 g碳酸氫鈉用1 000 mL蒸餾水混勻。待完全溶解后通入95%氧氣和5%二氧化碳混合氣體30 min，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7.4。最后加入0.61 g氯化鈣試劑，待其完全溶解后，加入1 000 mL蒸餾水最后定容過濾，放入4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。正式實驗時，大鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉溶液40 mg/kg麻醉15 min后，注射抗凝液100 IU/100 g抗凝，待大鼠完全麻醉后開胸剪斷主動脈，心臟離體后立即放在4 ℃ K-H液中，用手指輕輕反復(fù)按壓心臟，擠出心臟內(nèi)部殘余的血液，迅速將心臟懸掛于已調(diào)試好的離體灌流裝置上，在肺動脈剪口使冠脈中液體順利排出，保持體外循環(huán)完整通暢。模型組、電針預(yù)處理組大鼠平衡灌注20 min,缺血40 min，再灌注2 h；對照組無缺血再灌注操作，全程平衡灌注180 min。

1.5檢測指標及方法

1.5.1TTC染色法測定心肌梗死面積 灌流結(jié)束后,快速取下心臟，用提前預(yù)冷的PBS溶液沖洗心臟組織，用濾紙吸干，置于培養(yǎng)皿中，于-20 ℃冷凍30 min。冷凍期間，配置1% TTC染色液避光、37 ℃恒溫箱預(yù)熱30 min，隨后取冷凍心臟沿縱軸進行組織切片。將心肌組織切片浸于預(yù)熱的染色液內(nèi)，用錫紙完全遮蓋后，在37 ℃恒溫箱中進行避光孵育15～30 min。隨后將組織從染色液中取出，濾紙吸干后置于4%甲醛溶液中固定2～4 h。隔日進行拍照分析，選用圖像分析軟件Image Pro Plus 6.0來測定梗死區(qū)(染色后呈蒼白色)面積，梗死面積用梗死區(qū)(蒼白區(qū))面積/全心面積(磚紅色區(qū)+蒼白區(qū))的百分比表示。

1.5.2比色法檢測冠脈流出液中LDH含量 停灌注前20 min取2 mL灌流液-80 ℃保存，按LDH檢測試劑盒(可見光比色法)說明書測定灌流液中LDH含量。

1.5.3Western blot檢測心肌組織中TNF-α、IL-6表達情況 灌流結(jié)束后，剪取各組大鼠心肌相同部位組織，加入適量預(yù)冷的PBS緩沖液對心肌組織進行反復(fù)沖洗。每0.1 g組織加入1 mL裂解液，低溫勻漿、離心取上清，BCA法進行蛋白定量，制備分離膠、濃縮膠，上樣、恒壓100 V電泳、恒流200 mA進行轉(zhuǎn)膜，浸于用TBST制作的5%的脫脂奶封閉液中，在室溫條件下封閉1 h，一抗孵育過夜，棄掉一抗稀釋液，用TBST緩沖液沖洗10 min，重復(fù)洗4次,然后在室溫條件下加入TNF-α、IL-6二抗稀釋液(1∶5000稀釋于含5%脫脂奶粉的TBST中)孵育1 h。棄掉二抗稀釋液，用凝膠膜浸在TBST中沖洗10 min，重復(fù)洗4次。ECL反應(yīng)顯色、曝光成像，凝膠成像系統(tǒng)進行灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠心肌梗死面積比較 對照組無心肌梗死區(qū)域，模型組梗死面積為(23.81±1.43)%，電針預(yù)處理組梗死面積為(13.44±0.64)%，電針預(yù)處理組梗死面積明顯小于模型組(P<0.05)。各組大鼠心肌梗死面積TTC染色情況見圖1。

圖1 各組大鼠TTC染色心肌梗死情況

2.2各組大鼠冠脈流出液中LDH活性比較 模型組LDH含量明顯高于對照組(P<0.05)，電針預(yù)處理組明顯低于模型組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠冠脈流出液中LDH活性比較

2.3各組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6表達情況比較 模型組大鼠心肌組織中TNF-α、IL-6相對表達量明顯高于對照組(P均<0.05)，電針預(yù)處理組均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖3及圖4。

圖3 各組大鼠心肌組織中TNF-α表達情況

圖4 各組大鼠心肌組織中IL-6表達情況

3 討 論

缺血性心臟病患者經(jīng)過介入或者溶栓等再灌注治療后多會發(fā)生心肌缺血再灌注損傷，大量心肌酶釋放入血，表現(xiàn)為LDH和肌酸激酶(CK)明顯升高，引發(fā)心律失常、心肌梗死面積擴大及心室舒縮功能降低等，甚至導(dǎo)致死亡[8-9]。大量研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注損傷的形成與氧自由基大量增多、炎性反應(yīng)、鈣離子超載、細胞凋亡及線粒體結(jié)構(gòu)功能改變等密切相關(guān)[10-11]。

目前研究證實，再灌注治療可以激活心肌組織中的TLR4通路產(chǎn)生免疫反應(yīng)，促進NF-κB磷酸化和其下游炎性因子如TNF-α、IL-6等的釋放[12-13]。TNF-α是一種常見的促炎性因子，主要來源于單核細胞和巨噬細胞，正常心肌組織中含量較少，而在心肌缺血、缺氧狀態(tài)下合成釋放大量增加[14]。TNF-α能夠誘導(dǎo)表面黏附分子趨化到血管內(nèi)皮細胞上，阻礙缺血區(qū)域的血液循環(huán)；還可以加重鈣離子超載，促進氧自由基的生成，導(dǎo)致心肌組織損傷[15-16]。IL-6能夠促進細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達，使其結(jié)合到心肌細胞表面，造成心肌細胞損傷[17]。另外炎癥細胞浸潤及炎癥介質(zhì)的釋放可使大量中性粒細胞浸潤阻塞血管，引起再灌注后血液無復(fù)流現(xiàn)象[18]。陳晨等[19]報道，心肌缺血再灌注模型大鼠血清中TNF-α、IL-6水平明顯升高，這些致炎因子促使心肌梗死面積和再灌注后無復(fù)流范圍擴大。因而抑制TNF-α、IL-6等炎性因子的釋放對防治缺血再灌注損傷具有重要價值。

Murry等[20]首次發(fā)現(xiàn)缺血預(yù)處理能夠減輕犬再灌注后的心肌組織損傷，為治療缺血性心臟病提供了新理念，但這種干預(yù)方式存在局限性，在臨床中需要考慮到患者的耐受程度及不良反應(yīng)等。針刺可以激發(fā)體內(nèi)內(nèi)源性保護機制，而且其不良反應(yīng)較少，不會對組織器官形成損傷[21]。目前，電針預(yù)處理常用于缺血再灌注動物實驗研究中，穴位主要選取心包經(jīng)絡(luò)穴和八脈交會之內(nèi)關(guān)穴。陳松等[22]研究發(fā)現(xiàn)，電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對結(jié)扎左冠狀動脈前降支方法制備的心肌缺血再灌注大鼠心肌線粒體具有明顯保護作用。吳松等[23]研究了不同電針內(nèi)關(guān)預(yù)處理時間對心肌缺血再灌注損傷的保護作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)電針預(yù)處理均能降低心肌組織和血清中促炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平，升高抗炎性因子IL-4、IL-10水平，調(diào)控炎性因子間的平衡狀態(tài)以保護心臟，且預(yù)處理2 h和3 h的保護效應(yīng)更好。石力等[24]研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)前7 d進行低頻電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理能降低結(jié)扎冠狀動脈前降支缺血30 min后的ST段值及LDH含量，增加心肌組織中乙酰膽堿受體M2AChR、α7nAChR的表達，進而抑制炎癥反應(yīng),減少細胞凋亡，但高頻電針內(nèi)關(guān)穴預(yù)處理對上述指標無明顯影響。由此可知，針刺干預(yù)時間及電針參數(shù)的選擇均可以影響療效，目前尚沒有統(tǒng)一的針刺處理方案。

本實驗采用離體心肌缺血再灌注模型進行研究，結(jié)果顯示模型組出現(xiàn)明顯心肌梗死，冠脈流出液中LDH含量及心肌組織中TNF-α、IL-6表達量明顯升高，說明缺血再灌注后心肌組織中發(fā)生炎癥反應(yīng)，心肌受到損害；與模型組比較，電針預(yù)處理組心肌梗死面積縮小，冠脈流出液中LDH含量及心肌組織中TNF-α、IL-6表達量明顯降低，說明電針預(yù)處理可以下調(diào)致炎因子的表達，減輕心肌炎性損傷，起到保護心肌作用。

綜上所述，電針作為一種良性刺激，能夠增加大鼠心肌缺血耐受性，對抗心肌缺血再灌注損傷，從而縮小心肌梗死面積，減輕炎癥反應(yīng)，減少損傷，肯定了電針預(yù)處理的干預(yù)價值。但是本實驗只是明確了電針內(nèi)關(guān)預(yù)處理可以減少促炎因子的表達，能夠?qū)θ毖俟嘧⑿募〗M織產(chǎn)生保護效應(yīng)，沒有對其他可能影響因素做進一步探討，其具體作用機制還有待研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。