余艷芳，趙開順，屠春林，陳娓，梁海鷹，易清清，梁凱軼，孫亞蒙

結(jié)核病已成為嚴(yán)重危害全球范圍內(nèi)人群健康的公共衛(wèi)生問題之一，近年來廣泛耐藥結(jié)核?。╡xtensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB）和耐多藥結(jié)核病（multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB）使結(jié)核病的臨床治療困難重重。為了避免結(jié)核分枝桿菌發(fā)生獲得性耐藥，WHO建議結(jié)核病及疑似結(jié)核病患者在行標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核治療前進(jìn)行藥敏試驗［1］，以早期發(fā)現(xiàn)耐藥結(jié)核病（drug-resistant tuberculosis，DRTB）。但傳統(tǒng)細(xì)菌耐藥檢測手段如表型藥物敏感性試驗（drug susceptibility test，DST）耗時較長（一般需要3～4周），同時因細(xì)菌生長不良或受其他微生物污染影響而導(dǎo)致結(jié)果不確定，進(jìn)而延誤患者治療［2］。

近年隨著結(jié)核分枝桿菌耐藥分子機(jī)制的闡明，采用分子生物學(xué)技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥基因已成為診斷DR-TB的方法［3］?；|(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF）是美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的痕量核酸檢測系統(tǒng)，其具有檢測時間快、準(zhǔn)確度高、成本低等特點［4］。近年隨著GridION（Oxofrd Nanopore Technologies）測序平臺不斷更新，利用納米孔測序儀獲得較大測序深度后得到的校正序列與Sanger測序相比準(zhǔn)確率高達(dá)100%，且其鑒定微生物及微生物耐藥性的費(fèi)用與Illumina二代測序相當(dāng)，但測序時間極大縮短了［5-6］。本研究以最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）法為藥敏試驗的“金標(biāo)準(zhǔn)”，以三代測序驗證突變基因，旨在分析MALDI-TOF在結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測中的應(yīng)用價值，以期為DR-TB防控方案的制定提供一定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2016—2020年上海市嘉定區(qū)中心醫(yī)院肺科診治的200例復(fù)治肺結(jié)核患者的痰液標(biāo)本，其中男性157例，女性43例；年齡24～65歲，平均（45.0±10.3）歲。

1.2 主要試劑和材料 iPLEX Pro高保真基因型分析試劑盒購自Agena Bioscience公司（美國，10160），三代測序Barcode試劑盒購自O(shè)xford Nanopore Technologies（英國，EXP-NBD104、EXP-NBD114），三代測序建庫試劑盒購自O(shè)xford Nanopore Technologies（英國，SQK_LSK109），測序芯片R 9.4.1購自O(shè)xford Nanopore Technologies（英國，F(xiàn)LOMIN106），Invitrogen Platinum ⅡTaq熱啟動DNA聚合酶（美國，14966001），芯片清洗試劑盒購自O(shè)xford Nanopore Technologies（ 英 國，SQK-RBK004）， 細(xì) 菌 DNA/RNA提取試劑盒購自寧波市重鼎生物技術(shù)有限公司（中國，ZDTG-91-100），AMPure XP Beads購自 Beckman Coulter。

1.3 檢測方法

1.3.1 MIC法 采用BACTEC MGIT960全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀快速培養(yǎng)痰液標(biāo)本，鑒定為陽性的結(jié)核分枝桿菌采用MIC法進(jìn)行藥敏試驗［7］。使用細(xì)菌DNA/RNA提取試劑盒提取結(jié)核分枝桿菌DNA樣本，嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。以MIC法為本次藥敏試驗的“金標(biāo)準(zhǔn)”，評價MALDI-TOF對結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢出情況。

1.3.2 MALDI-TOF 采用MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥情況及耐藥相關(guān)位點突變結(jié)果，具體如下：DNA模板經(jīng)多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增后，采用蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）去除殘留的脫氧核糖核苷三磷酸，再采用雙脫氧核苷三磷酸、與待測位點的前模板匹配的特異性單堿基延伸引物進(jìn)行待測位點單個堿基的延伸反應(yīng)，根據(jù)延伸產(chǎn)物分子質(zhì)量特異性區(qū)分待測位點的堿基類型?？菇Y(jié)核藥物及其對應(yīng)的基因耐藥位點參考文獻(xiàn)［8-12］，見表1。引物和單堿基延伸引物的設(shè)計及MALDI-TOF具體操作過程參照TSUCHIDA等［13］研究。

1.3.3 三代測序 采用三代測序驗證MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)位點突變的準(zhǔn)確性，具體如下：從200份結(jié)核分枝桿菌DNA標(biāo)本中隨機(jī)選取20份，其對應(yīng)的MIC結(jié)果見表2，分別針對表1中基因的突變熱點區(qū)域設(shè)計引物，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物長度約為500 bp，三代測序多重PCR的引物序列見表3。使用三代測序建庫試劑盒建庫上機(jī)，上機(jī)操作流程參照MORRISON等［14］的方法。具體操作步驟如下：將20份結(jié)核分枝桿菌DNA的多重PCR產(chǎn)物稀釋至終濃度為100～200 fmol的48 μl無核酶水中，采用NEB末端修復(fù)和加T/A尾試劑盒進(jìn)行末端修復(fù)，采用AMPure XP Beads磁珠純化修復(fù)產(chǎn)物，將產(chǎn)物稀釋至終濃度為100～200 fmol的22.5 μl無核酶水中，分別連接標(biāo)簽序列（EXP-NBD104 and EXP-NBD114 kits，ONT）。磁珠純化上述產(chǎn)物并采用Qubit 3.0熒光定量儀進(jìn)行定量分析，使用SQK-LSK109連接建庫試劑盒（ONT官方試劑）進(jìn)行混合樣本建庫，混合樣本終濃度為100～200 fmol/L，樣本終體積為65 μl。連接建庫產(chǎn)物并采用磁珠純化后洗脫在15 μl體系中，終濃度需為50～100 fmol/L，取12 μl 混合SQB和LB后，點樣到測序芯片R 9.4.1，使用GridION×5測序3 h，下機(jī)后提取FastQ數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。測序完成后，清洗芯片（EXP-WSH003，ONT）并質(zhì)檢，當(dāng)活性孔≥800時，可以用于下一次測序，將芯片按要求保存于4 ℃冰箱中。堿基識別軟件為Guppy 4.5.2，數(shù)據(jù)質(zhì)控軟件為NanoPlot，單堿基變異（single nucleotide variant，SNV）位點識別使用Medaka。

表1 抗結(jié)核藥物及其對應(yīng)的基因耐藥位點Table 1 Anti-tuberculosis drugs and their corresponding gene resistance sites

表2 20株結(jié)核分枝桿菌對應(yīng)的MIC結(jié)果（μg/ml）Table 2 MIC results corresponding to 20 strains of Mycobacterium tuberculosis

表3 三代測序多重PCR的引物序列Table 3 Primer sequence of third generation sequencing multiplex PCR

（續(xù)表1）

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計數(shù)資料以相對數(shù)表示；以MIC法為藥敏試驗的“金標(biāo)準(zhǔn)”，計算MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥的靈敏度、特異度及正確率；采用Kappa檢驗進(jìn)行一致性分析，以Kappa值＜0.40為一致性較差，Kappa值為0.40～0.75為一致性中等，Kappa值＞0.75為一致性較高。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌的耐藥情況 以MIC法為藥敏試驗的“金標(biāo)準(zhǔn)”，MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對利福平耐藥的靈敏度為93.1%、特異度為87.8%、正確率為90.5%、Kappa值為0.810；MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥的靈敏度為77.2%、特異度為98.6%、正確率為85.0%、Kappa值為0.701；MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對左氧氟沙星耐藥的靈敏度為77.8%、特異度為99.0%、正確率為88.5%、Kappa值為0.769；MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對莫西沙星耐藥的靈敏度為85.7%、特異度為76.2%、正確率為78.5%、Kappa值為0.516；MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對阿米卡星耐藥的靈敏度為94.9%、特異度為89.4%、正確率為90.5%、Kappa值為0.736；MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對卷曲霉素耐藥的靈敏度為88.9%、特異度為87.8%、正確率為88.0%、Kappa值為0.654，見表4。

表4 MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌對抗菌藥物耐藥的效能（株）Table 4 Efficacy of MALDI-TOF in detecting antimicrobial resistance of Mycobacterium tuberculosis

2.2 三代測序驗證MALDI-TOF檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)位點突變的準(zhǔn)確性 三代測序時間為3 h，獲得518.8 M數(shù)據(jù)（其中堿基質(zhì)量值＜9的數(shù)據(jù)有88.79 M），測序質(zhì)量通過讀長N50=530，平均測序質(zhì)量為12.7，見表5。下機(jī)數(shù)據(jù)的fast5文件轉(zhuǎn)換為fastq文件（guppy_basecaller -i fast5_pass-s fast5_pass --config dna_r9.4.1_450bps_hac.cfg -r --num_callers 4 --cpu_threads_per_caller 4 --fast5_out）（Guppy Version 4.5.2），數(shù)據(jù)質(zhì)控（guppy_basecaller -i fast5_pass -s fast5_pass --config dna_r9.4.1_450bps_hac.cfg -r --num_callers 4 --cpu_threads_per_caller 4 --fast5_out），拆分20個樣本的barcode（guppy_barcoder guppy_barcoder -i sample_fastq -s .--barcode_kits "EXP-NBD104 EXP-NBD114" --allow_inferior_barcodes），去除各樣本barcode序列（guppy_barcoder --input_path sample_fastq --save_path . --config configuration.cfg --trim_barcodes），以結(jié)核分枝桿菌H37Rv的序列為參考基因組，識別各樣本的SNV位點（medaka_haploid_variant -i sample.fastq-r ref.fna -t 16 -m r941_min_high_g360）。在20份分枝結(jié)核桿菌中，MALDI-TOF檢測的耐藥突變位點與三代測序檢測的耐藥突變位點一致率為100%；此外，三代測序還獲得MALDITOF檢測體系中未涉及的突變位點，見表6～7。

表5 基于NanoPlot的數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果Table 5 Data quality control results based on NanoPlot

表6 MALDI-TOF檢測的耐藥相關(guān)位點突變結(jié)果Table 6 Mutation results of drug resistance related sites detected by MALDI-TOF

3 討論

中國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，近年來結(jié)核分枝桿菌原發(fā)耐藥率和繼發(fā)耐藥率不斷上升，復(fù)治患者耐藥率相對較高，究其原因主要為疾病初期未采取合理的治療方案、抗生素濫用、服藥不規(guī)律和患者依從性差等［15］。近年隨著分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)步，臨床上可快速、敏感地檢測出結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株，進(jìn)而為臨床治療方案的制定提供實驗依據(jù)，也為結(jié)核病的控制提供了理論基礎(chǔ)［2］。

表7 三代測序檢測的耐藥相關(guān)位點突變結(jié)果Table 7 Mutation results of drug resistance related sites detected by thirdgeneration sequencing

既往研究表明，95%以上的利福平耐藥菌株突變發(fā)生在rpoB基因81bp（密碼子507-533）的耐藥決定區(qū)，密碼子531位點是最常見的突變位點［16］，但rpoB基因突變與利福平耐藥的關(guān)系存在地域性差異［17］。有研究發(fā)現(xiàn)，異煙肼耐藥主要與KatG、inhA 基因突變相關(guān)［18］，KatG基因密碼子315是引起異煙肼耐藥的主要突變位點（76.9%）［19］；但也有研究結(jié)果顯示，KatG基因密碼子315的突變頻率很低［20］。在全球范圍內(nèi)，結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥、對利福平敏感是最常見的耐藥模式，而采用標(biāo)準(zhǔn)抗結(jié)核治療模式會導(dǎo)致治療失敗或MDT-TB患者數(shù)量增加，甚至轉(zhuǎn)變?yōu)閄DR-TB，因此快速、準(zhǔn)確地檢測結(jié)核分枝桿菌耐藥情況十分重要［21-23］。

根據(jù)WHO的建議，治療MDR-TB患者時應(yīng)首先進(jìn)行氟喹諾酮類和二線注射類藥物的藥敏試驗或分子藥敏試驗，然后再確認(rèn)治療方案，以減少XDR-TB的產(chǎn)生［1］。gyrA基因、gyrB基因、rrs基因和eis基因分別是氟喹諾酮類和二線注射類藥物分子耐藥的主要機(jī)制，可以解釋60%～90%的耐藥情況［24-26］。本研究結(jié)果顯示，MALDI-TOF與MIC法檢測結(jié)核分枝桿菌對莫西沙星耐藥的Kappa值為0.516，分析MIC結(jié)果和三代測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，20例標(biāo)本均顯示對氟喹諾酮類藥物耐藥，同時三代測序結(jié)果還顯示，gyrA基因61密碼子和284密碼子均突變。但也有研究證實，gyrA基因284密碼子的突變與氟喹諾酮類藥物的耐藥無關(guān)［27］，故gyrA基因61密碼子突變與氟喹諾酮類藥物耐藥的關(guān)系值得進(jìn)一步研究。此外，本研究結(jié)果還顯示，20份結(jié)核分枝桿菌中7號菌株gyrB基因1510位點是G→A的突變，該位點是MALDI-TOF未檢測出的突變位點，該標(biāo)本臨床藥敏試驗結(jié)果顯示對氟喹諾酮類耐藥，需持續(xù)關(guān)注。

綜上所述，通過MALDI-TOF檢測的結(jié)核分枝桿菌對常用抗結(jié)核藥物耐藥結(jié)果與MIC法高度或中度一致，其檢測的耐藥突變位點與三代測序檢測的耐藥突變位點一致率為100%，故MALDI-TOF檢測的結(jié)核分枝桿菌耐藥結(jié)果可以作為臨床鑒定結(jié)核分枝桿菌藥敏試驗結(jié)果的有效補(bǔ)充。

作者貢獻(xiàn)：余艷芳、屠春林進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計；余艷芳、孫亞蒙進(jìn)行研究的實施與可行性分析；余艷芳、趙開順、陳娓、梁海鷹進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；易清清、梁凱軼進(jìn)行結(jié)果分析與解釋；余艷芳負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文；屠春林負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。