張歡，石文健，劉永亮，李景武，張于，董桂蘭，董偉

細胞能量代謝功能失調(diào)是癌癥的重要特征，與線粒體DNA突變、線粒體酶缺陷或改變的癌基因/腫瘤抑制因子導致的線粒體功能障礙有關［1］。線粒體是一種多功能細胞器，與多種信號通路有關，包括能量代謝、氧化應激、細胞凋亡、細胞周期、自噬和免疫過程。線粒體功能障礙可通過各種機制促進癌細胞進展為抗凋亡/化學抗性和/或侵襲性表型［2］。已有研究證實包括低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor，HIF）-1ɑ和TP53在內(nèi)的致癌基因/抑癌基因可通過調(diào)節(jié)線粒體呼吸和細胞能量代謝而導致腫瘤發(fā)生及不良預后［3-4］。一項基于蛋白質(zhì)組學垂體腺瘤的分子網(wǎng)絡研究結果表明，線粒體功能障礙、氧化應激、細胞周期紊亂和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）信號傳導異常與垂體腺瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關［5］。本研究通過熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測垂體腺瘤患者的HIF-1α、溶酶體相關膜蛋白1（lysosomal associated membrane protein 1，LAMP1）、線粒體內(nèi)膜融合蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）及線粒體外膜轉位酶 20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOMM20）的mRNA相對表達量，并分析低氧、線粒體功能與垂體腺瘤發(fā)生發(fā)展的關系，以期為開發(fā)基于線粒體途徑的新候選靶點提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016—2018年在唐山市人民醫(yī)院接受內(nèi)鏡經(jīng)蝶手術治療的84例垂體腺瘤患者作為研究對象，其中男31例，女53例；年齡20～73歲，平均（45.9±1.4）歲；腫瘤體積0.05～45.50 cm3，平均（11.30±1.47）cm3；Ki-67增殖指數(shù)1%～20%，平均（4.5±0.4）%；無侵襲性（Knosp分級［6］Ⅰ～Ⅱ級）38例，侵襲性（Knosp分級Ⅲ～Ⅳ級）46例；腫瘤起源［7］：類固醇生成因子1（steroidogenic factor 1，SF-1）42例，POU結構域1類轉錄因子1（POU class 1 homeobox 1，POU1F1）37例，T盒垂體限制轉錄因子19（T-box pituitary restricted transcription factor 19，TBX19）5例；磁共振成像檢查顯示海綿竇受壓37例（44.05%）；隨訪27～69個月，復發(fā)22例（26.2%）。本研究經(jīng)唐山市人民醫(yī)院倫理委員會審核批準（審批號：RMYYLLKS-2020-004），所有患者或法定代理人對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 HIF-1α、LAMP1、OPA1、TOMM20的 mRNA 相對表達量檢測方法 稱量腫瘤標本10 mg，采用總RNA提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)，貨號：DP419〕提取總RNA，利用反轉錄試劑盒（美國Thermo公司生產(chǎn)，貨號：#1622）合成cDNA，而后采用TaqManTM基因表達反應試劑盒（美國Thermo公司生產(chǎn)，貨號：4369016）進行RT-PCR，熱循環(huán)條件為：95 ℃變性 10 s，60 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 10 s，共40個循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算HIF-1α、LAMP1、OPA1、TOMM20的mRNA相對表達量，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗。HIF-1α mRNA相對表達量與LAMP1、OPA1及TOMM20的mRNA相對表達量的相關性分析采用Pearson相關分析。采用多因素Logistic回歸分析探討垂體腺瘤患者腫瘤侵襲和復發(fā)的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α、LAMP1、OPA1、TOMM20的 mRNA 相對表達量及相關性分析 RT-PCR結果顯示，垂體腺瘤患者HIF-1α mRNA相對表達量為0.008～0.210，平均（0.087±0.005）；OPA1 mRNA相對表達量為0.006～0.063， 平 均（0.031±0.002）；LAMP1 mRNA相對表達量為0.019～0.345，平均（0.156±0.009）；TOMM20 mRNA相對表達量為0.037～0.504，平均（0.226±0.011）。Pearson相關分析結果顯示，HIF-1α mRNA相對表達量與LAMP1、OPA1及TOMM20的mRNA相對表達量均呈正相關（r值分別為0.814、0.600、0.771，P值均＜0.001）。

2.2 侵襲性與無侵襲性垂體腺瘤患者臨床資料比較 與無侵襲性垂體腺瘤患者相比，侵襲性垂體腺瘤患者的腫瘤體積較大，Ki-67增殖指數(shù)、海綿竇受壓發(fā)生率、復發(fā)率及HIF-1α mRNA相對表達量較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；侵襲性與無侵襲性垂體腺瘤患者的性別、年齡、腫瘤起源及LAMP1、OPA1、TOMM20 mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

2.3 復發(fā)與未復發(fā)的垂體腺瘤患者臨床資料比較與未復發(fā)的垂體腺瘤患者相比，復發(fā)的垂體腺瘤患者Ki-67增殖指數(shù)、侵襲性腫瘤者占比、海綿竇受壓發(fā)生率、TOMM20 mRNA相對表達量較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；復發(fā)與未復發(fā)的垂體腺瘤患者的性別、年齡、腫瘤體積、腫瘤起源及HIF-1α、LAMP1、OPA1 mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表3。

2.4 多因素Loistic回歸分析 將表2、表3中有統(tǒng)計學差異的指標作為自變量，腫瘤侵襲情況、復發(fā)情況分別作為因變量，變量賦值見表4，進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示，腫瘤體積、海綿竇受壓、HIF-1α mRNA相對表達量是垂體腺瘤患者腫瘤侵襲的獨立影響因素（P＜0.05），見表5；TOMM20 mRNA相對表達量是垂體腺瘤患者腫瘤復發(fā)的獨立影響因素（P＜0.05），見表6。

表2 侵襲性與無侵襲性垂體腺瘤患者臨床資料比較Table 2 Comparison of clinical data between invasive patients and noninvasive patients with pituitary adenoma

表3 復發(fā)與未復發(fā)的垂體腺瘤患者臨床資料比較Table 3 Comparison of clinical data between recurrence patients and nonrecurrence patients with pituitary adenoma

表4 垂體腺瘤患者腫瘤侵襲或復發(fā)影響因素的多因素Logistic回歸分析變量賦值Table 4 Variable assignment of multivariate Logistic regression analysis of influencing factors of tumor invasion or recurrence in patients with pituitary adenoma

表5 垂體腺瘤患者腫瘤侵襲影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 5 Multivariate Logistic regression analysis of influencing factors of tumor invasion in patients with pituitary adenoma

表6 垂體腺瘤患者腫瘤復發(fā)影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 6 Multivariate Logistic regression analysis of influencing factors of tumor recurrence in patients with pituitary adenoma

3 討論

氧穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)是調(diào)節(jié)生理氧變化最基本的細胞過程，氧穩(wěn)態(tài)紊亂可導致包括惡性腫瘤在內(nèi)的各種疾?。?］。缺氧與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關，缺氧/氧感應信號在調(diào)節(jié)惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有關鍵作用［9］。

HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β組成的異源二聚體，在常氧環(huán)境下可經(jīng)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解，但該途徑在缺氧環(huán)境下可受到抑制［10］。HIF-1α可反映機體缺氧程度，通過代謝、增殖和血管生成等多個生理過程而參與癌癥的發(fā)生發(fā)展［11］。HIF-1α表達量上調(diào)有助于血管生成、代謝重編程、細胞外基質(zhì)重塑、上皮間質(zhì)轉化、運動、侵襲、轉移、腫瘤干細胞維持、腫瘤免疫逃逸以及抵抗化療、放療［12］。HIF-1α能通過促進內(nèi)皮細胞向低氧組織遷移，即上皮間質(zhì)轉化，進而促進新生血管形成，最終導致腫瘤的惡性轉歸［13］。本研究結果顯示，HIF-1α mRNA相對表達量是垂體腺瘤患者腫瘤侵襲的獨立影響因素。

線粒體功能障礙是多種疾病發(fā)生的標志，功能失調(diào)的線粒體可以導致基因表達改變，從而改變細胞的形態(tài)和功能［14］。LAMP屬于糖基化蛋白家族成員，主要存在于溶酶體膜上，不同組織中其表達可能有所不同，可影響細胞的吞噬、自噬、脂質(zhì)轉運和衰老等過程［15］。OPA1可調(diào)控腫瘤血管的生成和發(fā)育，臨床實驗已證實小分子OPA1抑制劑可以抑制腫瘤生長［16］。TOMM20已被證實是外線粒體膜復合物易位酶的一個重要亞基，負責識別線粒體蛋白并將其從細胞溶質(zhì)轉移到線粒體中［17］，較大線粒體質(zhì)量和較高線粒體活性細胞的TOMM20表達水平較高［18］，TOMM20水平已成為臨床評估多種腫瘤患者預后的生物標志物之一［19-21］。有研究表明，TOMM20過表達能夠促進結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，而siRNA介導的TOMM20表達可抑制細胞增殖、遷移和侵襲［19］。TOMM20表達直接影響線粒體功能，包括ATP產(chǎn)生和膜電位的維持，這有助于致瘤細胞活動，包括調(diào)節(jié)S期細胞周期和細胞凋亡。在間質(zhì)性腫瘤中，TOMM20是誘導上皮間質(zhì)轉化和代謝重編程的標志物［20］。本研究結果顯示，TOMM20 mRNA相對表達量是垂體腺瘤患者腫瘤復發(fā)的獨立影響因素。

HIF-1α、線粒體功能障礙均會導致能量代謝重編程，包括限制線粒體能量代謝、增加葡萄糖攝取量和增強糖無氧酵解能力［22］。因此HIF-1α與線粒體功能障礙之間可能存在聯(lián)系。本研究結果顯示，垂體腺瘤患者HIF-1α mRNA相對表達量與LAMP1、OPA1及TOMM20的mRNA相對表達量均呈正相關，推測垂體腺瘤患者機體缺氧狀態(tài)可導致線粒體功能改變，而腫瘤細胞代謝重編程可進一步誘導腫瘤上皮間質(zhì)轉化，從而導致不良預后。

綜上所述，HIF-1α mRNA相對表達量與LAMP1、OPA1、TOMM20的mRNA相對表達量均呈正相關，且HIF-1α mRNA相對表達量是垂體腺瘤患者腫瘤侵襲的獨立影響因素，TOMM20 mRNA相對表達量是垂體腺瘤患者腫瘤復發(fā)的獨立影響因素。受限于實驗條件，本研究未進行線粒體數(shù)量、形態(tài)學和相關代謝產(chǎn)物的檢測，因此線粒體途徑是否可作為垂體腺瘤新的治療靶點仍需更多的臨床研究證實。

作者貢獻：石文建、劉永亮、董偉進行文章的構思與設計；張于進行數(shù)據(jù)的收集、整理、分析；李景武、董桂蘭進行結果分析與解釋；張歡撰寫、修訂論文；董偉負責文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負責、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。