楊 露，譚會澤，溫志芬，張祥斌，劉松柏，彭運智，鄒 軼，陳 丹，韓敏義

(溫氏食品集團股份有限公司農(nóng)業(yè)部動物營養(yǎng)與飼料學(xué)重點實驗室，廣東 云浮 527400)

隨著社會的進步和生活水平的提高，人們要求肉品質(zhì)不僅有營養(yǎng)價值，而且要色香味俱全。肉中的風(fēng)味主要包括鮮味、甜味、咸味、酸味和苦味五大類，而肉類及其制品的鮮味主要取決于氨基酸和核苷酸兩大類物質(zhì)。1985年在美國召開的第一次鮮味國際討論會上，確定了鮮味的概念，將谷氨酸鈉和5′-核糖核苷酸(5′-IMP、5′-GMP……)等化合物給予的獨特滋味稱為鮮味。研究證實，在畜禽肉中肌苷酸為鮮味最強的物質(zhì)，鳥苷酸和腺苷酸也發(fā)揮了鮮味作用，它們通過一系列的降解過程產(chǎn)生多種具有鮮味的代謝產(chǎn)物[1]。

目前用于雞肉中鮮味核苷酸的檢測方法有化學(xué)滴定法、紫外分光光度法和高效液相色譜法?；瘜W(xué)滴定法測定偏差較大，紫外分光光度法只能測定樣品中總核苷酸的量，現(xiàn)在普遍利用高效液相色譜法測定禽肉中的單種鮮味核苷酸含量[2]。本研究通過分析鮮味核苷酸的化學(xué)特性，結(jié)合禽肉中鮮味核苷酸的提取方法，最終提煉出一套前處理簡單方便快速且準確度高的可測定禽肉中三種鮮味核苷酸的高效液相色譜方法。

1 方法原理

樣品中的鮮味核苷酸經(jīng)5%高氯酸溶液提取，再與氫氧化鉀溶液發(fā)生反應(yīng)生成化學(xué)狀態(tài)穩(wěn)定的鹽類物質(zhì)，采用高效液相色譜(紫外檢測器)測定，外標法定量。

2 材料與方法

2.1 材料

取一定量新鮮肉雞胸肌樣品于-20℃條件下保存待用。

2.2 試劑

色譜純的甲醇，實驗室一級水，磷酸鹽緩沖溶液(pH 5.8)，無水磷酸二氫鉀，無水磷酸氫二鉀，高氯酸，5′-肌苷酸標準品(純度≥99%)，5′-鳥苷酸標準品(純度≥99%)，腺苷酸標準品(純度≥98%)。

2.3 儀器及耗材

高效液相色譜(配有紫外檢測器)，渦動儀，高速離心機，萬分之一分析天平，十萬分之一分析天平，超聲波清洗器，0.22 μm有機濾膜，pH值計，高速組織勻漿機等。

2.4 高效液相色譜條件

(1)色譜柱：TC-C18柱(5 μm,φ4.6 mm×250 mm)；

(2)柱溫：25℃；

(3)流動相：磷酸鹽緩沖溶液+甲醇(95+5)；

(4)流速：0.60 ml/min；

(5)進樣體積：20 μl；

(6)檢測波長：254 nm；

(7)梯度洗脫設(shè)置：0～10 min，99%磷酸鹽緩沖溶液和1%甲醇；12 min時，80%磷酸鹽緩沖溶液和20%甲醇保持6 min；2 min內(nèi)磷酸鹽緩沖溶液升至99%，再保持8 min。

2.5 樣品前處理

2.5.1試液制備

稱取攪碎、均質(zhì)的雞肉樣品2～3 g(精確到0.01 g)于50 ml離心管中，加20 ml在4℃冰箱中預(yù)冷1 h的5%高氯酸溶液，超聲波提取5 min，在4℃下4 000 r/min離心10 min，取上清液。沉淀物再加20 ml預(yù)冷的5%高氯酸溶液。重復(fù)上述步驟，合并所有上清液于50 ml錐形瓶中，并用0.5 mol/L的氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至5.8。從調(diào)好pH值的提取液中準確移取20 ml，定容到100 ml容量瓶中。取定容的試液適量經(jīng)0.22 μm濾膜過濾至進樣瓶中，待上機測定。

2.5.2回收率測定

將5′-IMP、5′-GMP、AMP三種物質(zhì)的標準溶液加入試樣后，按2.5.1節(jié)提供的方法處理制備樣品溶液，以考察前處理對回收率的影響，結(jié)果見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 結(jié)果計算

樣品中5′-IMP、5′-GMP、AMP三種鮮味核苷酸的含量Ci，按公式Ci=(CsAiV)/(Asm)計算。式中，Ci為樣品中各種物質(zhì)的含量，mg/g；Cs為標準工作液中各種物質(zhì)的濃度，mg/ml；Ai為樣品中各種物質(zhì)所對應(yīng)的峰面積響應(yīng)值；As為標準工作液中各種物質(zhì)所對應(yīng)的峰面積響應(yīng)值；V為樣品提取液的總體積,ml；M為樣品質(zhì)量,g。

測定結(jié)果用平行測定的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留4位有效數(shù)字。

3.2 標準曲線

將三種物質(zhì)的標準混合溶液配制成含5′-IMP為12.5、25.0、50.0、62.5、125.0 μg/ml的標準工作液，含5′-GMP和AMP為2.5、5.0、10.0、12.5、25.0 μg/ml的標準工作液，按2.4節(jié)設(shè)定色譜條件進行色譜分析，以各個物質(zhì)濃度為自變量(X)，相應(yīng)的色譜峰面積響應(yīng)值為依變量(Y)，建立標準曲線方程。結(jié)果表明,濃度為12.5～125 μg/ml，5′-IMP濃度與峰面積響應(yīng)值之間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程計算為：Y=39.939 530 1X-308.903 46，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。濃度為2.5～25.0 μg/ml，5′-GMP濃度與峰面積響應(yīng)值之間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程計算為：Y=61.583 628 7X-96.722 597，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 0。濃度為2.5～25.0 μg/ml，AMP濃度與峰面積響應(yīng)值之間具有良好的線性關(guān)系，回歸方程計算為：Y=76.170 150 8X-104.692 94，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 0。

3.3 回收率測定

將5′-IMP、5′-GMP、AMP三種物質(zhì)的標準溶液加入試樣后，按2.5.1節(jié)提供的方法處理制備樣品溶液，以考察前處理對回收率的影響。結(jié)果見表1。

表1 三種物質(zhì)回收率試驗結(jié)果

3.4 精密度測定

利用2.5.1設(shè)定條件測定一個雞肉樣品中三種核苷酸(5′-IMP、5′-GMP和AMP)的含量，測定5個平行，按2.4節(jié)設(shè)定條件進行高效液相色譜分析。對三種核苷酸的保留時間及含量的重現(xiàn)性進行分析，結(jié)果見表2。

4 討論

利用建立的方法可較好的測定雞肉中5′-肌苷酸、5′-鳥苷酸和腺苷酸三種核苷酸的含量。與以往的實驗方法相比，此法利用磷酸鹽緩沖液作為流動相，分離效果好。利用超聲提取各種物質(zhì)的效率高，結(jié)果平行性好。從精密度測定結(jié)果看出，5′-肌苷酸含量和保留時間相對標準偏差分別為0.165 6%和0.088 0%，5′-鳥苷酸含量和保留時間相對標準偏差分別為0.257 3%和0.065 0%，腺苷酸含量和保留時間相對偏差分別為0.279 4%和0.052 0%，三種核苷酸類物質(zhì)的回收率測定結(jié)果在90.00%～108.00%，滿足檢測實驗要求。以上結(jié)果表明該方法具有較好的精密度和較高的準確性，可用于大批量樣品中三種鮮味核苷酸含量的測定。

5 結(jié)論

利用高效液相色譜建立的測定雞肉中5′-肌苷酸(5′-IMP)、5′-鳥苷酸(5′-GMP)、腺苷酸(AMP)三種核苷酸含量的方法前處理簡單、快速、定性定量準確、回收率較高、重現(xiàn)性好，達到了快速準確檢測雞肉中鮮味核苷酸含量的要求。