胡如榮

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，廣泛分布于自然界及各類型水中，對(duì)消毒劑、干燥、紫外線等理化因素具有很強(qiáng)的耐受性，可引起多種疾病，國(guó)內(nèi)外都有被此污染的報(bào)道。因此，我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 8537《飲用天然礦泉水》2008版中就增加了對(duì)銅綠假單胞菌的要求，并于2018版中提高了對(duì)銅綠假單胞菌指標(biāo)的要求，2021年版《國(guó)家食品安全監(jiān)督抽檢實(shí)施細(xì)則》也將銅綠假單胞菌指標(biāo)作為包裝飲用水的重點(diǎn)監(jiān)測(cè)項(xiàng)目之一。2021年1-9月全國(guó)各省市場(chǎng)監(jiān)督管理局對(duì)包裝飲用水進(jìn)行抽檢，其中，微生物項(xiàng)目抽檢不合格的產(chǎn)品結(jié)果顯示，約95%為銅綠假單胞菌不合格。因此，準(zhǔn)確而快速地檢測(cè)礦泉水中銅綠假單胞菌污染情況，對(duì)于保障人民飲水安全和評(píng)價(jià)工廠檢測(cè)能力顯得尤為重要。

能力驗(yàn)證即通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)，按照預(yù)先設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則來(lái)評(píng)價(jià)參加者的能力。實(shí)驗(yàn)室可以利用能力驗(yàn)證的方法對(duì)檢測(cè)人員能力、方法驗(yàn)證、數(shù)據(jù)或結(jié)果的準(zhǔn)確性和不確定度進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)于滿足監(jiān)管機(jī)構(gòu)和提升公司產(chǎn)品出廠檢驗(yàn)準(zhǔn)確性具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室分別通過(guò)參加中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究試驗(yàn)測(cè)試評(píng)價(jià)中心ACAS-PT1117和大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司組織的銅綠假單胞菌能力驗(yàn)證和（定量）測(cè)量審核，來(lái)驗(yàn)證檢測(cè)中心出具的檢測(cè)報(bào)告是否具有良好的可靠性，并以此作為公司銅綠假單胞菌檢測(cè)質(zhì)量提升的理論支持。

一、材料和設(shè)備

1.原材料及主要試劑。標(biāo)準(zhǔn)樣，21-M797、21-Q246，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心;銅綠假單胞菌（定量測(cè)試）樣品-064，大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司;假單胞菌CN選擇性培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;營(yíng)養(yǎng)瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;氧化酶試紙、乙酰胺肉湯、鈉氏試劑、綠濃菌素測(cè)定培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;配置用水，檢測(cè)中心自制超純水。

2.主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備。超凈工作臺(tái)，SW-CJ-ID，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司;生化培養(yǎng)箱，SHP-150，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;顯微鏡，DYS系列，上海點(diǎn)應(yīng)光學(xué)儀器有限公司;暗箱式紫外分析儀，ZF-20D，上海寶山顧村電光儀器廠;高壓滅菌器，BSC-250，上海申安醫(yī)療器械廠;電子天平，0.1g/500g，雙節(jié)測(cè)試儀器廠;移液槍，1000-5000μL，Dragon-lab。

二、實(shí)驗(yàn)和方法

1.樣品預(yù)處理。分別依據(jù)ACAS-PT1117（2021）礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測(cè)能力驗(yàn)證參試指導(dǎo)書(shū)2.3條款和礦泉水中銅綠假單胞菌（定量）測(cè)量審核參試指導(dǎo)書(shū)的要求，對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。（1）中檢樣品：在無(wú)菌級(jí)的超凈工作臺(tái)上打開(kāi)西林瓶，用移液槍加入10mL無(wú)菌水，反復(fù)吹吸溶解后轉(zhuǎn)移至容量為1000mL的三角瓶中，再反復(fù)用余下的無(wú)菌水清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收至三角瓶中，最終三角瓶中的菌液定容為520mL，即為待測(cè)原液A。（2）大連中食國(guó)實(shí)樣品：用稀釋液2-4mL對(duì)西林瓶再水化，反復(fù)清洗西林瓶，并回收至無(wú)菌瓶中，稀釋液合計(jì)40mL;將10mL稀釋液添加到240mL的無(wú)菌生理鹽水中，最終定容至250mL，即為待測(cè)液原液A。

2.樣品稀釋。將待測(cè)原液A參照國(guó)標(biāo)GB 4789-2016《菌落總數(shù)測(cè)定》樣品稀釋方法進(jìn)行相應(yīng)的稀釋。（1）中檢原液：用移液槍分別吸取50mL原液A、450mL無(wú)菌水，混勻即為10倍稀釋待測(cè)液B;用移液槍分別吸取50mL待測(cè)液B、450mL無(wú)菌水，混勻即為100倍稀釋待測(cè)液C;用移液槍分別吸取50mL待測(cè)液C、450mL無(wú)菌水，混勻即為1000倍稀釋待測(cè)液D（待測(cè)液B、C、D分別平行制備2份）。（2）大連中食國(guó)實(shí)原液：取25mL待測(cè)原液A加入到225mL稀釋液中，定容至250mL，作為10倍稀釋待測(cè)液B，以此類推依次作相應(yīng)梯度稀釋。

3.樣品過(guò)濾。樣品過(guò)濾需在超凈工作臺(tái)進(jìn)行。先用無(wú)菌鑷子夾取無(wú)菌濾膜的邊緣部分，將糙面朝上，貼放在已滅菌的濾床上，將250mL無(wú)菌濾杯固定好，再分別將待測(cè)原液A（ 1份）、10倍稀釋待測(cè)液B（2份）、100倍稀釋待測(cè)液C（2份）、1000倍稀釋待測(cè)液D（2份）通過(guò)孔徑0.45μm的濾膜過(guò)濾，最后將過(guò)濾后的濾膜貼在已制備好的CN瓊脂平皿上，平鋪時(shí)要避免在瓊脂和濾膜之間留有氣泡，并做好陰性和陽(yáng)性對(duì)照。培養(yǎng)溫度：36±1℃，培養(yǎng)周期：24-48h。

三、結(jié)果與分析

1.結(jié)果觀察與計(jì)數(shù)。中檢樣品21-Q246、21-M797在10倍稀釋液B和100倍稀釋液C平皿形成了可計(jì)算的分散的典型菌落，而待測(cè)原液A的菌落數(shù)目多不可計(jì)，1000倍稀釋液D未長(zhǎng)菌。大連中食國(guó)實(shí)樣品-064待測(cè)原液A和10倍稀釋液B平皿形成了可計(jì)算的分散的典型菌落，100倍稀釋液C和1000倍稀釋液D均未長(zhǎng)菌。

2.可疑菌落的確證性試驗(yàn)。根據(jù)GB 8538-2016《飲用天然礦泉水檢驗(yàn)方法》57.5.3-57.5.4條款要求，對(duì)可疑菌落進(jìn)行確證性試驗(yàn)，菌落選擇和驗(yàn)證步驟詳見(jiàn)表1。

樣品21-Q246、21-M797和樣品-064上的產(chǎn)熒光（非藍(lán)/綠）菌落經(jīng)常規(guī)生化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和綠膿菌素試驗(yàn)，鑒定為銅綠假單胞菌。結(jié)合CN平皿上可疑菌落的計(jì)數(shù)結(jié)果，樣品21-Q246報(bào)送結(jié)果為540CFU/250mL，樣品21-M797報(bào)送結(jié)果為890CFU/250mL，樣品-064報(bào)送結(jié)果為141CFU/250mL。

3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果。樣品21-Q246的檢測(cè)結(jié)果為540CFU/250mL，樣品21-M797的檢測(cè)結(jié)果為890CFU/250mL，取得z值分別為-2.8和-2.5，結(jié)果可疑，經(jīng)過(guò)對(duì)整個(gè)檢測(cè)過(guò)程的復(fù)盤(pán)排查，最終確認(rèn)影響因素主要有兩個(gè)：一是樣品預(yù)處理沒(méi)有充分混勻，原液稀釋時(shí)僅用移液槍來(lái)回吹吸;二是樣品快遞過(guò)程存活率低。對(duì)中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究試驗(yàn)測(cè)試評(píng)價(jià)中心的試驗(yàn)分析進(jìn)行改進(jìn)后，通過(guò)參加大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司測(cè)量審核，取得Z值為-1.68，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)室具備檢測(cè)銅綠假單胞菌的能力。

四、結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)參加由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院和大連中食國(guó)實(shí)檢測(cè)技術(shù)有限公司組織實(shí)施的礦泉水中銅綠假單胞菌檢測(cè)能力驗(yàn)證及定量測(cè)量審核實(shí)驗(yàn)，依據(jù)能力驗(yàn)證指導(dǎo)書(shū)及GB 8538-2016《飲用天然礦泉水檢測(cè)方法》對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，并總結(jié)了檢測(cè)過(guò)程的影響因素及一般步驟，供實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行能力驗(yàn)證或測(cè)量審核時(shí)參考。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同機(jī)構(gòu)提供的操作指導(dǎo)書(shū)存在比較大的差異，尤其在樣品預(yù)處理-樣品稀釋方面。另外，GB 8538-2016《飲用天然礦泉水檢測(cè)方法》中沒(méi)有稀釋方法，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)礦泉水樣品參照GB4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行相應(yīng)的稀釋處理，使濾膜上能夠形成分散的單一菌落，便于可疑菌落的觀察計(jì)數(shù)，為準(zhǔn)確報(bào)告飲用水中銅綠假單胞菌的污染情況提供保障。