陳思婷

(廣西科學院廣西紅樹林研究中心，廣西紅樹林保護與利用重點實驗室，廣西北海 536000)

0 引言

紅樹林具有重要的生態(tài)及經(jīng)濟價值，尤其是在固岸護堤、抵御海嘯臺風等自然災害、維持生物多樣性、凈化水質(zhì)、固碳及發(fā)展旅游業(yè)等方面具有重要作用。白骨壤(Avicenniamarina)是世界上分布最廣的紅樹植物，在我國主要分布在廣東、廣西、福建、海南和臺灣等省地。白骨壤為我國常見的先鋒紅樹植物樹種，分布廣泛，種子可進行有性生殖，根系發(fā)達，適合生長在貧瘠的裸露沙灘上，因此被稱為紅樹林先鋒樹種。

圍填海對海洋生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生了較大的影響，其對紅樹的影響主要體現(xiàn)在圍墾、養(yǎng)殖污染和淹水脅迫等方面[1]。1980年以來，圍填海造成全國紅樹林面積減少12 923.70 hm2[2]，因此研究圍填海導致紅樹林死亡的具體原因具有重要意義。葉綠素(Chlorophyll，Chl)含量是植物生長過程中一個重要的生理指標，由于其對周圍環(huán)境很敏感，且與植物的光合作用密切相關(guān)，被廣泛用作植物生長的常規(guī)測定指標。光照和低氧脅迫會影響葉綠素的含量。光照不足影響植物葉綠素的生物合成[3]，所以光照不足是葉綠素含量降低的重要原因之一。低氧脅迫是植物生長過程中遇到的重要非生物脅迫之一[4]。低氧脅迫下，植物處于缺氧狀態(tài)，其生理過程受到干擾，如水分失衡、膜結(jié)構(gòu)被破壞、有害代謝產(chǎn)物積累等。因此，低氧脅迫下植物葉綠素含量降低[5]，植物光合作用效率降低，而由于植物種類及脅迫時間、程度的差異使得葉綠素含量的變化各不相同[6-8]。低氧脅迫使植物營養(yǎng)物質(zhì)利用效率下降、光合作用減弱[9,10]，因此植物在低氧脅迫下呼吸與能量代謝會發(fā)生變化，使得植物在低氧脅迫下能夠存活。圍填海時，白骨壤的低氧脅迫耐受能力與其在被高嶺土覆蓋條件下的能量供應狀況有密切的聯(lián)系。如果植物體內(nèi)積累了較多的能量物質(zhì)或在低氧脅迫下養(yǎng)分消耗緩慢，植物就有較強的低氧脅迫耐受能力。而在植物能量產(chǎn)生過程中，細胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase,COX,EC1.9.3.1)和乙醇脫氫酶(Alcohol Dehydrogenase,ADH,EC1.1.1.1)發(fā)揮了重要的作用，是產(chǎn)生ATP的關(guān)鍵酶。由于細胞色素C氧化酶和乙醇脫氫酶活性易受環(huán)境變化的影響，研究白骨壤中這兩種酶的活性在低氧脅迫下的變化，對從呼吸與能量代謝方面闡明圍填海對白骨壤的影響具有重要作用。圍填海時白骨壤的指狀呼吸根被高嶺土覆蓋，指狀呼吸根缺氧，因此指狀呼吸根是測定細胞色素C氧化酶和乙醇脫氫酶活性的重要部位。

鐵山港欖根村陸域填土工作始于2012年左右，至2017年12月欖根村紅樹林區(qū)海域吹填工程已基本成型，陸域填土工程范圍亦完全到達紅樹林海岸邊緣。在海域吹填過程中，鄰近海域吹填工程邊緣紅樹林生境遭受嚴重威脅。紅樹林從這一時期開始受損，但這一時期紅樹林受損面積較小，暫發(fā)現(xiàn)4個受損紅樹林斑塊零星分布。隨著時間推移，紅樹林受損面積增加明顯，受損區(qū)域呈連片狀分布。2018年10月至2019年6月，海域吹填工程區(qū)東南和東北邊緣有所調(diào)整，陸域填土工程繼續(xù)開展。截至2020年4月，監(jiān)測區(qū)內(nèi)紅樹林受損面積已達17.18 hm2。圍填海工程導致高嶺土覆蓋在白骨壤的葉片和指狀呼吸根上，因此本文以圍填海不同區(qū)域不同生長狀態(tài)的白骨壤葉片和指狀呼吸根為材料，研究圍填海對白骨壤葉片葉綠素含量、NAD+/NADH比值、NADP+/NADPH比值、ATP含量和指狀呼吸根活力、有氧呼吸關(guān)鍵酶細胞色素C氧化酶和無氧呼吸關(guān)鍵酶乙醇脫氫酶活性的影響，以探討圍填海對白骨壤呼吸與能量代謝的影響，深入研究圍填海導致白骨壤死亡的生理機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣地概況及采樣

鐵山港是我國面積最大的天然白骨壤純林的生長地，并零星生長有桐花樹Aegicerascorniculatum、秋茄Kandeliaobovata和紅海欖Rhizophorastylosa。欖根村現(xiàn)存白骨壤林93.83 hm2，群落平均覆蓋度57%、平均密度55株/100 m2、平均高度2.08 m。鐵山港周邊缺少河流和淡水調(diào)節(jié)，灘涂泥沙質(zhì)、貧瘠，紅樹林生態(tài)系統(tǒng)脆弱。研究區(qū)域經(jīng)緯度為21°35′37.14″-21°36′31.63″N，109°36′56.05″-109°35′54.51″E。以白骨壤為研究對象，采集白骨壤葉片及指狀呼吸根植物材料。分別設置嚴重受損紅樹林區(qū)邊緣站位6個(ED1-ED6，以下簡稱ED)，項目監(jiān)測范圍內(nèi)紅樹林大斑塊中暫未顯示枯亡現(xiàn)象仍然正常生長的紅樹林調(diào)查站位3個(尚存活樣方AL1-AL3，以下簡稱AL)，正常紅樹林對照站位3個(對照組CK1-CK3，以下簡稱CK)，研究站位如圖1所示。ED組和AL、CK組的顯著差別在于：ED組出現(xiàn)白骨壤植株全株死亡的現(xiàn)象，紅樹植株死亡比例為(60.5±6.3)%，死亡植株均無葉片殘留(葉片殘留百分比可在一定程度上反應植株存活情況)，有一定比例的斷頂株數(shù)；AL、CK組僅出現(xiàn)輕微的葉片掉落情況和少量的斷頂株數(shù)。2020年3月6-7日在欖根村不同組區(qū)域取材：CK組，15個獨立生物學重復；AL組，15個獨立生物學重復；ED組，30個獨立生物學重復，共60個樣品。所有樣品均放置于低溫保溫箱中帶回實驗室，-80℃保存待測。測定前將白骨壤葉片及指狀呼吸根用超純水洗凈、擦干并稱重。葉綠素含量、NAD+/NADH比值、NADP+/NADPH比值和ATP含量用白骨壤的第二對葉測定，根系活力、細胞色素C氧化酶活性和乙醇脫氫酶活性用白骨壤的指狀呼吸根測定。

圖1 研究站位圖

1.1.2 主要試劑和設備

輔酶ⅠNAD+/NADH含量試劑盒(批號：G0801W)、輔酶Ⅱ NADP+/NADPH含量試劑盒(批號：G0802W)、ATP含量試劑盒(磷鉬酸比色法，批號：G0815W)、植物根系活力試劑盒(批號：G0124W)、線粒體復合體Ⅳ細胞色素C氧化酶試劑盒(批號：G0848W96)、乙醇脫氫酶(ADH)試劑盒(批號：G0806W)均購自蘇州格銳思生物科技有限公司。

主要儀器設備為多功能酶標儀(Molecular Devices；VERSA max)。

1.2 方法

1.2.1 葉綠素含量測定

參照顧駿飛等[11]的方法測定葉綠素含量。

1.2.2 呼吸與能量代謝生理指標測定

NAD+/NADH比值用輔酶ⅠNAD+/NADH含量試劑盒測定，NADP+/NADPH比值用輔酶Ⅱ NADP+/NADPH含量試劑盒測定，ATP含量用ATP含量試劑盒(磷鉬酸比色法)測定，指狀呼吸根活力用植物根系活力試劑盒測定，細胞色素C氧化酶活性用線粒體復合體Ⅳ細胞色素C氧化酶試劑盒測定,乙醇脫氫酶活性用乙醇脫氫酶(ADH)試劑盒測定。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計及繪圖使用Excel軟件(Microsoft office 365,Redmond,WA,USA)。圖表中的數(shù)值用平均值±SD的形式表示，顯著性分析使用t檢驗，*P<0.05，表示差異顯著，**P<0.01，表示差異極顯著。

**P<0.01，表示差異極顯著

**P<0.01，表示差異極顯著

2 結(jié)果與分析

2.1 圍填海對白骨壤葉片葉綠素含量的影響

從圖2可以看出，與CK組相比，AL組及ED組的白骨壤葉片葉綠素總含量均顯著減少。與CK組相比，ED組的白骨壤葉片葉綠素總含量極顯著減少，下降53%；與AL組相比，ED組的白骨壤葉片葉綠素總含量顯著減少，下降31%。說明海岸工程圍填海導致的高嶺土溢流淤積對白骨壤葉片產(chǎn)生遮光影響，使得葉綠素合成減少，進而影響白骨壤的光合作用。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；FW，鮮重

2.2 圍填海對白骨壤葉片NAD+/NADH比值及NADP+/NADPH比值的影響

從圖3可以看出，與CK組相比，AL組及ED組的白骨壤葉片NAD+/NADH比值及NADP+/NADPH比值均顯著降低。與正常生長的白骨壤相比，ED組白骨壤葉片NAD+/NADH比值下降61%，NADP+/NADPH比值下降62%；與AL組相比，ED組的白骨壤葉片NAD+/NADH比值及NADP+/NADPH比值分別下降45%及48%。因此，海岸工程圍填海導致的高嶺土溢流淤積堵塞了白骨壤葉片和指狀呼吸根的氣孔，使得白骨壤可以獲取的氧氣量減少，從而減少NAD+及NADP+的合成，進而使NAD+/NADH比值及NADP+/NADPH比值下降。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.3 圍填海對白骨壤葉片ATP含量的影響

如圖4所示，與CK組相比，AL組的白骨壤葉片ATP含量顯著減少。與正常生長的白骨壤相比，ED組的白骨壤葉片ATP含量下降95%，說明海岸工程圍填海導致的高嶺土溢流淤積堵塞白骨壤葉片和指狀呼吸根的氣孔，使得白骨壤可以獲取的氧氣量減少，從而減少ATP的合成，進而導致ATP含量下降。

2.4 圍填海對白骨壤指狀呼吸根活力的影響

與CK組相比，AL組及ED組的白骨壤指狀呼吸根的活力顯著下降；與正常生長的白骨壤相比，ED組的白骨壤指狀呼吸根活力下降62%；與AL組相比，ED組的白骨壤指狀呼吸根的活力顯著下降(圖5)。說明海岸工程圍填海導致的高嶺土溢流淤積堵塞白骨壤指狀呼吸根的氣孔，使得白骨壤可以獲取的氧氣量減少，產(chǎn)生低氧脅迫，進而抑制白骨壤根系活力。

2.5 圍填海對白骨壤指狀呼吸根細胞色素C氧化酶和乙醇脫氫酶活性的影響

從圖6可以看出，與CK組相比，ED組的指狀呼吸根細胞色素C氧化酶和乙醇脫氫酶活性明顯升高，指狀呼吸根細胞色素C氧化酶活性升高108%，乙醇脫氫酶活性升高20%，說明與CK組相比，ED組的有氧呼吸活性和無氧呼吸活性均升高。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

3.1 圍填海對白骨壤葉片葉綠素含量的影響

光照不足會影響植物葉綠素的生物合成[3]，黑暗中大部分植物無法合成葉綠素[12]，而葉片長期遮光會導致葉綠素含量顯著下降[13]。長期遮光降低植物光合碳同化能力及光合作用關(guān)鍵酶活性，導致葉綠素合成減少，葉片褪綠。葉綠素酸酯a加氧酶(CAO)將葉綠素酸酯a (Chlide a)轉(zhuǎn)化為葉綠素酸酯b (Chlide b)。擬南芥CAO在黑暗下表達量很低，但在光照條件下表達量顯著上調(diào)[14]。水稻OsCAO1在黑暗和光照條件下的表達模式與擬南芥CAO相似。葉綠素合酶(CHLG)將Chlide a和Chlide b轉(zhuǎn)化為葉綠素a和葉綠素b。擬南芥CHLG在見光后表達量逐漸上調(diào)。長期遮光不利于植物轉(zhuǎn)綠，光通過調(diào)控葉綠素生物合成途徑中的關(guān)鍵基因影響葉綠素生物合成。氧氣充足時植物葉綠素含量維持在一個較高的水平，低氧脅迫時葉綠素含量下降[15]。圍填海導致白骨壤葉片氣孔被高嶺土堵塞，光照被高嶺土阻斷，葉綠素生物合成減少，葉綠素含量下降。

3.2 圍填海對白骨壤呼吸與能量代謝的影響

低氧脅迫往往造成糖酵解及三羧酸循環(huán)的代謝過程變緩甚至停滯，導致還原型輔酶Ⅰ(NADH)向氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)的再生過程受到抑制進而阻止ATP的產(chǎn)生[16]。植物細胞在低氧脅迫條件下，正常有氧呼吸產(chǎn)生ATP的途徑受阻，轉(zhuǎn)而通過乙醇發(fā)酵和乳酸發(fā)酵途徑產(chǎn)生少量的ATP。圍填海導致嚴重受損區(qū)的白骨壤葉片ATP含量下降95%(圖4)，其原因是ATP合成減少。

在逆境條件下，細胞器結(jié)構(gòu)會被破壞，最終將導致細胞相關(guān)生理功能的降低乃至喪失[17]。對黃瓜的研究結(jié)果表明，低氧脅迫下根尖細胞受到傷害，線粒體內(nèi)嵴減少[18]。本研究結(jié)果表明，受損白骨壤指狀呼吸根活性下降(圖5)，可能是隨著細胞器結(jié)構(gòu)的逐漸降解，化學反應效率不可避免地下降，使得同化力減弱，并最終導致根活力下降，究其原因正是由于線粒體抗氧化系統(tǒng)的異常所導致。

當白骨壤指狀呼吸根剛被高嶺土覆蓋時，白骨壤指狀呼吸根還可以利用胞間氧進行氧化磷酸化。隨著胞間氧的消耗，氧分壓下降，植物表現(xiàn)出通過上調(diào)細胞色素C氧化酶的活性來有效地利用不斷減少的氧氣進行有氧呼吸。氧作為電子傳遞鏈的最終電子受體，低氧脅迫直接影響以氧為底物的細胞色素C氧化酶。白骨壤指狀呼吸根被高嶺土覆蓋，使得植物氧化磷酸化過程受到很大的影響，通過氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP有限，必須通過無氧呼吸生成ATP，為維持能量供應，就需要提高指狀呼吸根乙醇脫氫酶活性。

4 結(jié)論

高嶺土溢流淤積，使其附著于白骨壤葉片和指狀呼吸根上，白骨壤葉片被遮光，葉片和指狀呼吸根的氣孔被堵塞。葉片被遮光導致葉綠素含量下降，葉片和指狀呼吸根的氣孔被堵塞導致白骨壤遭受低氧脅迫，因此葉片NAD+/NADH比值及NADP+/NADPH比值下降，葉片ATP含量下降，指狀呼吸根活性下降，細胞色素C氧化酶和乙醇脫氫酶活性上升。