廖 馨，楊明柳

(廣西科學院廣西紅樹林研究中心，廣西紅樹林保護與利用重點實驗室，廣西北海 536000)

0 引言

紅樹林是生長在熱帶和亞熱帶陸海交界處潮間帶的木本植物群落，是陸地向海洋過渡的特殊生態(tài)系統(tǒng)，是維持近岸生物多樣性和生態(tài)安全的關鍵屏障[1]。我國現有紅樹林面積相對于1973年減少41%[2]，調查評估發(fā)現紅樹林減少的原因95%是由于人類活動的影響[3]。其中，沿海城市的填海造地、港口建設、圍墾養(yǎng)殖等海岸工程是造成濱海濕地喪失和紅樹林生態(tài)系統(tǒng)退化的重要原因之一，也是最直接的原因[4]。國際學者主要關注海岸工程對濕地生物多樣性及生態(tài)過程的影響，側重于探索海岸工程引發(fā)的生態(tài)環(huán)境效應[5]。國內學者過去多局限于通過估算濕地面積、評估濕地功能退化等方法研究海岸工程對濱海濕地的影響[6]，近年來海岸工程與濕地功能喪失之間的關系研究也逐漸受到關注，如有文獻報道渤海灣、膠州灣、珠江口等地的圍填海對近岸底棲生物造成不同程度的干擾，大型底棲動物、魚類的豐度和多樣性都有所下降[7-10]。不同生物的生理習性存在差異，對生態(tài)環(huán)境擾動的響應不同，使得量化海岸工程對生物資源的影響十分困難，特別是在紅樹林生態(tài)系統(tǒng)，國內外專門針對海岸工程影響紅樹林生物多樣性和生物量的基礎研究還較少。海岸工程疏浚和吹填的過程中產生大量懸浮泥沙，掩埋了紅樹林的呼吸根，導致紅樹死亡；泥沙導致水體混濁、溶解氧濃度降低，損害魚類鰓部的濾水和呼吸功能從而導致魚類死亡[10,11]；懸浮物造成水體透明度的下降，影響浮游植物的光合作用，進而影響以浮游生物為食的大型底棲動物的正常生長；另外，許多大型底棲動物幼體營浮游生活，懸浮物堵塞幼體的鰓部致其死亡。紅樹林是眾多海洋動物的繁殖場、幼體棲息地，底棲動物幼體的死亡將影響紅樹林生物多樣性的可持續(xù)發(fā)展[12]。

環(huán)境DNA不僅包含實時的物種信息，而且還包含過去數日內的物種信息[13]。因此環(huán)境DNA 是一個極有價值的信息載體，目前已被應用于生物多樣性監(jiān)測[14,15]、特定物種生物量估測、珍稀物種發(fā)現、入侵物種監(jiān)控[16]、隱存種發(fā)現、群落系統(tǒng)發(fā)育重建、物種間食物鏈關系分析等領域[17-19]。相比傳統(tǒng)的直接采樣，環(huán)境DNA分析技術有著無創(chuàng)、高效、靈敏、經濟等特點。紅樹林作為一個關注相對較少的生態(tài)系統(tǒng)，環(huán)境DNA的技術應用較少，廣西紅樹林研究中心在國際國內率先應用環(huán)境DNA技術開展紅樹林的大型底棲動物多樣性和物種生物量的研究，并在本論文中呈現初步應用的結果。本研究利用環(huán)境DNA技術結合高通量測序及熒光定量PCR，分析海岸工程影響下死亡紅樹林、嚴重退化紅樹林、尚存活紅樹林以及對照組紅樹林4種樣地底棲動物多樣性及優(yōu)勢物種生物量空間差異，旨在評估環(huán)境DNA技術在紅樹林底棲生物多樣性和生物量研究中的可行性，并揭示海岸工程對紅樹林底棲生物資源的影響，為評估海岸工程的生態(tài)效應與紅樹林濕地生物資源保護提供理論數據及科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

根據無人機航拍和實地勘察的海岸工程周邊區(qū)域情況，設置采樣點如圖1所示，植被覆蓋度為0的死亡紅樹林樣地(以下簡稱D樣地) 6個(圖1中D1-D6)，植被覆蓋度≤30%的嚴重退化紅樹林樣地(以下簡稱ED樣地) 6個(圖1中ED1-ED6)，尚存活紅樹林樣地3個(以下簡稱AL樣地) 3個(圖1中AL1-AL3)，紅樹林對照區(qū)樣地(以下簡稱CK樣地) 3個(圖1中CK1-CK3)，每個樣地中設置10 m×10 m的采樣樣方，采樣點經緯度見表1。2020年3月6日及7日在上述18個采樣樣方中各采集3份沉積物樣品，每份樣品為采集于10棵樹下1-5 cm表層的混合沉積物，約50 g左右，低溫保存帶回實驗室后凍于-20℃冰箱。同時，按照《海洋監(jiān)測規(guī)范》GB 17378.7-2007和《海洋調查規(guī)范》GB/T 12763.6-2007，進行大型底棲動物的采集：每個樣地設置4個小樣方，采用25 cm×25 cm定量樣方框，深度0-30 cm，采集沉積物，過篩后帶回實驗室進行大型底棲動物的判讀和生物量、優(yōu)勢物種的計算。該方法在后述中簡稱為傳統(tǒng)“樣方法”。

圖1 樣品采集地

表1 采樣點經緯度

1.2 方法

1.2.1 環(huán)境DNA提取

每份樣品的沉積物用攪拌機混勻后凍干，稱取0.3 g，使用DNeasy Power soil試劑盒(Qiangen公司)提取沉積物環(huán)境總DNA，提取方法參照產品說明書。使用Nanodrop One (Thermo Scientific公司)測定總DNA的濃度，分析A260/A280、A260/230數值，并電泳檢驗DNA質量。每份樣品設置3個生物學重復。

1.2.2 優(yōu)勢物種選取

將所采集的定量樣品及時用75%酒精固定，待樣品完全固定后，進行樣品鑒定和稱重，并計算大型底棲動物的棲息密度、樣方平均生物量，根據生物量的排序選擇本項工作中的優(yōu)勢物種。

1.2.3 熒光定量PCR特異性引物設計

在Genbank中搜索優(yōu)勢物種的DNA條形碼序列，使用Primer3Plus設計優(yōu)勢物種及內參的熒光定量PCR引物，經驗證篩選后，得到本論文所用的引物。

1.2.4 相對生物量分析

將每個樣地提取的3份沉積物DNA混合，對優(yōu)勢物種及內參進行熒光定量PCR實驗。實驗使用RR42LR試劑盒(TAKARA公司)，實驗體系為10 μL SYBR ExTaq mix，2 μL DNA，0.4 μL 正向引物，0.4 μL反向引物，7.2 μL 超純水，在Bio-Rad熒光定量PCR儀上進行擴增，運行程序如下：熱啟動95℃，30 s；循環(huán)擴增程序95℃，5 s，60℃，30 s，循環(huán)40次；熔解曲線程序。

1.2.5 數據處理和作圖

熒光定量PCR數據處理采用2-ΔΔCt法，本報告中數據處理和作圖使用Excel和GraphPad Prism 7.0軟件，數據統(tǒng)計采用單因素t檢驗。

1.2.6 高通量測序

為更好地進行數據的統(tǒng)計分析，本項實驗隨機選取CK，AL，ED，D樣地各3個樣方，即12個樣方進行高通量測序并研究調查區(qū)域生物多樣性。每個樣方取3份沉積物樣本分別按1.2.1方法提取沉積物總環(huán)境DNA后等量混合，使用針對線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ (COI)的通用引物mlCOlintF：5′-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3′和jgHCO2198：5′-TAIACYTCIGGRTGICCRAARA-AYCA-3′[20]，進行PCR擴增。PCR擴增使用ABI 2720型PCR儀、TransStart Fastpfu DNA Polymerase (全式金公司)、20 μL反應體系，以盡可能使用低循環(huán)數擴增和保證每個樣品擴增的循環(huán)數統(tǒng)一為原則，根據預實驗的結果，選擇35個循環(huán)進行PCR擴增。PCR產物切膠回收后經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送上海凌恩生物公司進行Illumina PE250 文庫構建和測序。

1.2.7 生物信息分析

根據overlap關系，對Illumina PE250測序得到的PE reads進行拼接，同時對序列質量進行質控和過濾。區(qū)分樣本后進行可操縱分類單元(Operational Taxonomic Units，以下簡稱OTU)聚類分析和物種分類學分析，使用Usearch (v10，http://drive5.com/uparse/)進行OTU的生物信息統(tǒng)計分析。采用RDP classifier 貝葉斯算法對 97%相似水平的 OTU 代表序列進行分類學分析，并分別在各個分類水平：domain(域)、kingdom(界)、phylum(門)、class(綱)、order(目)、family(科)、genus(屬)、species(種)上統(tǒng)計各樣本的群落組成。通過Excel繪制不同分類水平下的群落結構組份圖，并基于bray-curtis 算法分析樣本間群落組成的層次聚類。

2 結果與分析

2.1 環(huán)境DNA提取

提取18個樣方，每個樣方3個樣本的沉積物總DNA后，對AL、ED、D和CK樣地的DNA濃度、A260/A280和A260/A230數據進行統(tǒng)計分析。如圖2a所示，相同重量的凍干沉積物所提取的DNA濃度由低到高為D

**P<0.01表示差異極顯著

2.2 優(yōu)勢物種選取

根據傳統(tǒng)“樣方法”的大型底棲動物調查結果，將該區(qū)域所有樣方物種平均生物量進行排序。表2所示為生物量排名前十的優(yōu)勢物種，其中6種為軟體動物，4種為甲殼動物，這10種物種生物量占總生物量的比例達到92.34%(該部分結果詳見本刊高霆煒等《海岸工程對北海鐵山港紅樹林大底棲動物群落的影響》)。因為并非所有表中物種都能查到DNA barcode的信息，所以根據Genbank中DNA barcode序列的情況，選取扁平擬閉口蟹(16S rRNA， genbank No.:AB002128.1)、明秀大眼蟹(16S rRNA，genbank No.:LC097096.1)、珠帶擬蟹守螺(18S rRNA，genbank No.:AM932846.1)和紅樹蜆(COI，genbank No.:MN849878)作為本實驗的檢測對象(4個物種在表2中用加粗標記)。

表2 傳統(tǒng)底棲調查方法得到的生物量排名前十的物種

2.3 熒光定量PCR

經引物篩選，使用細菌16S rRNA和真菌ITS作為內參，檢測上述4種優(yōu)勢物種相對生物量所用的引物如表3所示。

表3 引物列表

如圖3所示，兩種甲殼動物DNA的相對表達量在D樣地和ED樣地中明顯降低。由于方差較大，明秀大眼蟹16S rRNA的相對表達量在各樣地間差異不顯著，但相對表達量的平均值有明顯差別，例如ED樣地的平均表達量相當于AL樣地的50.6%，D樣地的表達量僅相當于AL樣地的16.08%。扁平擬閉口蟹的16S rRNA 的相對表達量在AL樣地和CK樣地這兩種相對健康的紅樹林樣地中與退化紅樹林中有顯著性差異，ED樣地和D樣地中的相對表達量較AL樣地中分別下降87.96%和72.06%。兩種軟體動物的DNA相對表達量顯示出和甲殼動物不一樣的趨勢：珠帶擬蟹守螺18S rRNA的相對表達量在ED樣地最高，D樣地和AL樣地差異不大，提示該物種在海岸工程脅迫下生物量幾乎沒有改變；紅樹蜆的數據和珠帶擬蟹守螺有相似處，紅樹蜆COI基因的相對表達量在AL樣地、ED樣地、D樣地中均比CK樣地高，其中AL樣地最高。

*P<0.05表示差異顯著，**P<0.01表示差異極顯著

2.4 高通量測序OTUs數量

根據生物信息學比對結果，環(huán)境DNA中共得到4 651個OTUs樣地，能比對到29個門、100個綱、315個目、955個科、2 419個屬、4 046個種。將不屬于本研究關注范圍的細菌、真菌、浮游藻類的相關OTUs以及人、牛等物種造成的DNA污染剔除，并將讀數<100的OTUs也剔除，最后在門的水平上，CK樣地鑒定出14個，AL樣地鑒定出12個，ED樣地鑒定出14個，D樣地鑒定出10個；在綱的水平上，CK樣地鑒定出27個，AL樣地鑒定出27個，ED樣地鑒定出30個，D樣地鑒定出27個；在目的水平上，CK樣地鑒定出67個，AL樣地鑒定出77個，ED樣地鑒定出85個，D樣地鑒定出74個；在科的水平上，CK樣地鑒定出180個，AL樣地鑒定出187個，ED樣地鑒定出188個，D樣地鑒定出171個；在屬的水平上，CK樣地鑒定出254個，AL樣地鑒定出294個，ED樣地鑒定出287個，D樣地鑒定出296個；在種的水平上，CK樣地鑒定出290個，AL樣地鑒定出333個，ED樣地鑒定出316個，D樣地鑒定出350個(圖4)。各個樣地在各個分類水平上能鑒定出的OTUs數量并沒有顯著差異。

圖4 各樣地不同分類水平下OTUs數量(讀數≥100)

2.5 底棲生物物種群落結構組成分析

根據分類學分析結果，可以得知一個或多個樣本在各分類水平上的分類學比對情況。其結果包含了兩個信息：樣本中含有何種OTUs；樣本中各分類水平上的OTUs序列數，即相對豐度。使用Excel對不同分類水平的群落結構按百分比作圖。圖5a展示了簡明分類組分圖，分類單元有：藻類、真菌/細菌、無脊椎動物和脊椎動物。通過組分圖可以直觀地看出在各樣地中，屬于無脊椎動物OTUs的序列數最多，ED、D兩個樣地的藻類、真菌的占比相對于CK、AL樣地較多，原因在于ED樣地和D樣地受到海岸工程的影響使其沉積物理化性質發(fā)生改變，造成藻類和真菌的快速繁殖。圖5b按門水平展示了各樣地無脊椎動物的群落結構，相對豐度較高的門有節(jié)肢動物門(Arthropoda)、 環(huán)節(jié)動物門(Annelida)、軟體動物門(Mollusca)、刺胞動物門(Cnidaria)，其中ED、D樣地中環(huán)節(jié)動物門所占百分比明顯比CK、AL樣地多，刺胞動物也相對多，而CK和AL兩種尚存活紅樹林樣地以及對照紅樹林樣地中的軟體動物占比相對更多。在脊索動物水平上， D樣地的鳥綱OTUs序列顯著多，這一結果推測是因為D樣地紅樹死亡，植被覆蓋度幾乎為0，所以鳥糞更易掉落到沉積物上而造成的，其余各樣地脊索動物下屬各綱的群落結構并沒有明顯的規(guī)律。輻鰭魚綱(Actinopterygii)和海鞘綱(Ascidiacea)在CK和AL樣地相對更多，CK2、AL2、ED1、ED3、D1樣方出現了較多的屬于哺乳動物綱的序列(圖5c)。究其原因，追溯到科的水平，這幾個樣地注釋到了鼠科序列，鼠科的活動隨機性較強，造成各樣地的哺乳動物OTUs序列數沒有規(guī)律性。ED2樣地中兩棲綱(Amphibia)的OTUs序列占比高達95.12%，追溯其原因，顯示在科的水平該樣地有69 050條序列注釋到角花蟾科，占據ED2樣地脊索動物OTUs總序列數的95.08%，推測因采樣時剛好采集到該科物種的排泄物或者卵，造成該科物種序列數遠遠高于其他樣地。因節(jié)肢動物門的序列在各樣地中均占據較高比例，屬于優(yōu)勢類群，因此繪制節(jié)肢動物門各綱的群落結構組分圖(圖5d)。從圖5d中可以看出昆蟲綱的序列在節(jié)肢動物門中占比最高，從35.43%(ED2)到93.11%(AL1)；其次是軟甲綱(Malacostraca)，占比從0.88%(AL3)到51.05%(ED2)。

圖5 物種組成結構示意圖

2.6 樣本聚類樹

將每種樣地3個樣方門水平上的OTUs的序列數平均后，通過bray-curtis算法計算樣本間基于群落組成(門水平)的層次聚類分析。如圖6所示，左邊為聚類樹，右邊為群落結構組分。圖6的物種囊括了高通量測序得到的所有門，包括細菌、真菌、藻類等。從圖6中可以看出，CK和AL聚類在一起，相關性最近，隨后是ED樣地，D樣地的群落結構相關性最遠。

圖6 樣本聚類樹與群落結構組合分析

3 討論

3.1 環(huán)境DNA技術研究生物量變化的初步探討

環(huán)境DNA技術是一種新興的技術，該技術主要應用于生物多樣性的調查、入侵物種和珍稀物種的監(jiān)測，也可用于水體環(huán)境中生物量的預測，例如魚類產量的預測等。在紅樹林研究中，尚未有人使用此技術對底棲生物的生物量進行調查，本次研究是全球范圍內首次在紅樹林中使用環(huán)境DNA技術開展生物量的研究。不同物種代謝能力不同，其釋放DNA至環(huán)境中的速率也不同，因此環(huán)境DNA還不適合研究整個環(huán)境中所有動物生物量的變化。同種物種的不同個體向環(huán)境中釋放DNA的速率相似，因此環(huán)境中某物種的DNA表達量可提示生物量的多少。本研究選擇4種優(yōu)勢物種進行相對生物量的研究，結果顯示退化紅樹林中，蟹類的相對生物量下降，提示海岸工程在疏浚和吹填施工過程產生了大量泥沙淤積，泥沙掩埋紅樹林的呼吸根，造成紅樹林的死亡，對蟹類的生境造成脅迫，蟹類的生物量受到影響。

將環(huán)境DNA中的相對生物量和傳統(tǒng)調查結果(詳見本刊高霆煒等《海岸工程對北海鐵山港紅樹林大底棲動物群落的影響》)進行比較發(fā)現，兩者整體變化趨勢相符，說明環(huán)境DNA作為載體研究特定物種相對生物量的可行性和有效性。從數據比對中也可以看出環(huán)境DNA技術的優(yōu)勢：同期進行的傳統(tǒng)“樣方法”調查表明，紅樹蜆只出現在存活紅樹林中，甚至只在其中一個樣地有發(fā)現，而通過熒光定量PCR可以看出多個樣地中檢出有紅樹蜆的基因。究其原因，傳統(tǒng)“樣方法”因采樣困難費勞力，在10 m×10 m的樣方中僅挖掘25 cm×25 cm的小樣方，占樣方面積的0.0625%；而環(huán)境DNA技術因采樣方便，僅需數克沉積物，采樣可以覆蓋樣方內的每棵樹，因此研究結果更為精確。

明秀大眼蟹作為一個在紅樹林灘涂很活躍的蟹類物種，傳統(tǒng)“樣方法”的結果顯示AL樣地和CK樣地中沒有采集到該物種樣本，但ED樣地和D樣地中生物量較高，該結果按照常理推斷是不合理的。本研究的結果顯示，AL樣地和CK樣地中明秀大眼蟹的生物量相對高于ED樣地和D樣地。兩種調查方法的結果不同，推測原因除了傳統(tǒng)“樣方法”采樣范圍小外，也在于蟹類活動迅速，在傳統(tǒng)調查中可能缺失。

3.2 環(huán)境DNA結合高通量測序全面展現退化紅樹林底棲動物多樣性

提取的環(huán)境DNA選擇不同的引物可以分析特定類群的物種多樣性及群落結構。本研究采用的是線粒體細胞色素氧化酶Ⅰ的通用引物，這對引物主要針對后生無脊椎動物設計，但高通量測序的結果顯示樣品中也包含了部分細菌、真菌、藻類、原生動物和脊椎動物。從生物信息學比對后得到的所有物種門類結果(圖5a)來看，D樣地中的藻類豐度百分比高達20.24%，遠高于ED樣地中的6.85%、AL樣地的3.00%和CK樣地的1.84%，其中，D樣地硅藻門的相對豐度尤其高，占總藻類的99.42%。

為避免干擾項影響，把生物信息分析結果中的藻類、真菌、細菌以及一些明顯的干擾項(例如人、牛的DNA)去除，只對底棲動物的多樣性和群落結構進行分析。從OTUs的數量來看，各樣地能夠注釋到的各分類階層類群的數量并沒有顯著差異。從優(yōu)勢類群來看，節(jié)肢動物門、環(huán)節(jié)動物門和軟體動物門在各樣地中占優(yōu)勢。從群落結構來看，退化紅樹林的環(huán)節(jié)動物門和刺胞動物門的相對豐度高于AL和CK樣地，軟體動物門的豐度則相對低于AL和CK樣地。

如前述，傳統(tǒng)“樣方法”采樣的隨機性更強，而環(huán)境DNA方法因多點采樣所以更能全面展現樣地的生物多樣性；環(huán)境DNA中能夠鑒定出魚類、鳥類以及哺乳動物的鼠類甚至人類的序列，說明環(huán)境DNA中不僅包括實時的物種信息，而且也包括一定時間內在樣地中曾經出現的物種。由于生境、大小不同的物種采樣方式/技術標準有區(qū)別，并且也鮮有研究者能夠精通各種類群的形態(tài)分類學，傳統(tǒng)的紅樹林生物多樣性調查一般會分為浮游動植物、游泳動物、小型底棲和大型底棲動物四大類，而環(huán)境DNA技術采集的是環(huán)境樣品，如水、沉積物甚至空氣等，對樣品采集和現場處理的要求不高，采集到的樣本包含環(huán)境內所有的物種DNA在內，分析人員通過開放數據庫也容易得到所有類群的分子條形碼序列信息，通過生物信息學即可比對各類群的物種信息。綜上所述，環(huán)境DNA技術對生物多樣性的研究會更加全面。

3.3 環(huán)境DNA技術不足之處

環(huán)境DNA技術也有其不足的地方。第一，以本論文為例，有一部分通過傳統(tǒng)調查方法采集到的物種，在高通量數據中并沒有發(fā)現，這是由于生物信息學注釋依賴的是數據庫中已有物種的分子條形碼序列，而包括紅樹林在內的濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)甚至海洋生態(tài)系統(tǒng)中的很多物種，并沒有上傳有效的分子條形碼信息。第二，一對通用引物并不足以覆蓋所有的生物類群，例如部分真菌、部分刺胞動物的COI基因中含有內含子，因此COI并不是鑒定真菌和此部分刺胞動物的最優(yōu)條形碼基因；而且，海綿和刺胞動物的進化速率比其他兩側對稱的后生動物慢10-20倍，COI基因的變異不足以實現科以下級別的鑒定。第三，目前在生物多樣性研究上，環(huán)境DNA技術主要應用于水體如淡水湖泊和海洋中，而較少用于土壤/沉積物的多樣性研究，原因在于來源于水生動物的環(huán)境 DNA 在區(qū)域水體中呈現高度均勻分布狀態(tài)，而沉積物中的環(huán)境DNA則隨機性較大，在本實驗中也發(fā)現各樣地數據方差較大的現象。因此在后續(xù)實驗中，需要進一步地自主擴充濱海濕地生物的DNA barcode數據庫、設計針對不同類群的引物以及改進采樣方式和生物信息學算法以去除干擾項，使得此項技術能夠對紅樹林以及濱海濕地的生物多樣性進行更加全面、準確的科學研究，并努力形成標準化方法使之推廣應用。

4 結論

環(huán)境DNA技術是一項新興的技術，已經在各種生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性研究中廣泛開展，但是在紅樹林中的應用幾乎是空白。廣西紅樹林研究中心掌握了基于環(huán)境DNA和宏分子條形碼技術的紅樹林大型底棲動物多樣性研究方法，并一直在補充底棲物種的分子條形碼數據以完善該技術方法。本實驗首次在紅樹林中以環(huán)境DNA技術開展生物多樣性研究和優(yōu)勢物種生物量的研究。定量結果表明，海岸工程的脅迫對蟹類有顯著影響，對底棲貝類的影響不大；高通量測序得到的生物多樣性和群落結構結果表明，海岸工程引起的退化紅樹林中底棲生物群落結構發(fā)生了改變。和傳統(tǒng)調查方法結果的比對表明，環(huán)境DNA技術可以在紅樹林中研究生物多樣性和相對生物量的變化，并且比傳統(tǒng)調查方法的物種檢出率高，覆蓋度廣，可以涵蓋活動能力強的物種。環(huán)境DNA技術采樣更加方便快捷，更適合于對固定樣地開展生物多樣性和優(yōu)勢物種演替的持續(xù)性研究和監(jiān)測。