蘇君梅，池建偉，張瑞芬，張名位，賈栩超*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510640）（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610）

植物提取物因具有抗氧化，抗炎、提高免疫力、調節(jié)糖脂代謝、抗腫瘤等多種良好的生理活性[1-3]，已成為保健食品和功能食品的重要原料。然而，農(nóng)藥殘留超標嚴重阻礙了植物提取物行業(yè)的優(yōu)質高效發(fā)展[4,5]。苯并咪唑類殺菌劑是一類廣譜性殺菌劑，主要包括多菌靈、噻菌靈、阿苯達唑和苯菌靈等，被廣泛應用于農(nóng)業(yè)病原菌的防治。但該類殺菌劑具有致畸、致突變以及胚胎毒性，殘留超標會嚴重危害人體健康[6]。近年來，已有多起因該類農(nóng)藥殘留超標引起的安全問題和貿易受阻[7]。因此，建立一種高效的苯并咪唑類殺菌劑農(nóng)藥殘留脫除技術，對于提升植物提取物行業(yè)質量安全水平和促進產(chǎn)業(yè)快速良性發(fā)展具有重要意義。

近年來，MIPs作為一類性質穩(wěn)定、成本低且對目標物具有特異識別性能的新型吸附材料[8]，被廣泛應用于色譜分離[9]、固相萃取[10]和傳感器[11]等領域。FAROOQ等[12]以CBZ為模板分子，β-環(huán)糊精為功能單體，采用沉淀聚合法制備的MIPs，對CBZ的最大吸附容量為3.65 mg/g。Raif等[13]同樣以CBZ為模板分子，制備了具有磁性的MIPs，對CBZ的吸附能力為2.31±0.63 mg/g，可應用于蘋果和橙中CBZ殘留的檢測。MIPs的制備通常采用試錯法，該法試錯周期長且試錯成本高[14]。隨著計算化學和波譜技術的發(fā)展，基于計算機分子模擬以及波譜分析的預聚體篩選手段顯著提高了分子印跡材料的合成效率及吸附性能[15]。李璐等[16]借助Materials Studio軟件分子模擬和紫外光譜分析手段篩選功能單體和致孔劑，制備的溴氰菊酯MIPs靜態(tài)吸附量達到68.61 mg/g。Farrington等[17]通過核磁共振分析手段結合計算機分子模擬篩選功能單體及致孔劑，合成的MIPs對咖啡因表現(xiàn)出良好的富集效果。

目前，以苯并咪唑類農(nóng)藥為模板合成MIPs的研究已有報道，但合成的分子印跡材料主要以分析型的固相萃取填料為主，吸附量較低，且對同類型農(nóng)藥的吸附廣譜性較差。此外，目前選擇合成分子印跡材料功能單體和致孔溶劑的方法主要以試錯法為主，效率較低且盲目性高?；谟嬎銠C分子模擬合成苯并咪唑類殺菌劑MIPs的研究尚未見報導。因此急需科學高效的合成一種對苯并咪唑類殺菌劑具有廣譜吸附性的分子印跡材料。本研究以苯并咪唑類殺菌劑的共有母核結構AMB為模板分子，通過高斯化學計算軟件結合核磁波譜分析手段篩選功能單體種類、模板分子與功能單體比例以及致孔溶劑種類，通過正交試驗優(yōu)化合成MIPs的最優(yōu)條件，解決現(xiàn)有分子印跡材料合成周期長、廣譜性差的問題，為植物提取物中苯并咪唑類殺菌劑的脫除提供一種高性能吸附填料。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Avance III HD 400 M超導核磁共振波譜儀，德國Bruker公司；S-7300N鎢燈絲掃描電子顯微鏡，日本Hitachi公司；Gemini VII 2390全自動比表面積及孔隙分析儀，美國麥克公司；Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruker公司；Netzsch TG 209 F1 Libra熱重分析儀，德國Netzsch公司。

多菌靈（carbendazim，CBZ）、2-氨基苯并咪唑（2-aminobenzimidazole，AMB）、噻菌靈、阿苯達唑、苯菌靈購于上海阿拉丁生化科技有限公司；甲基丙烯酸（methacrylic acid，MAA）、丙烯酸（acrylic acid，AA）、丙烯酰胺（acrylamide，AAM）、甲基丙烯酸甲酯（methyl methacrylate，MMA）、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（N,N'-Methylenebisacrylamide，MBA）、衣康酸（itaconic acid，IA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二異丁腈購于上海麥克林生化科技有限公司；色譜級甲醇購于美國Fisher公司；其他試劑均為分析純。

1.2 分子印跡預聚體模擬篩選

1.2.1 功能單體種類及比例的篩選

以AMB為模板分子，選擇常見制備MIPs的功能單體甲基丙烯酸（MAA）、丙烯酸（AA）、丙烯酰胺（AAM）、甲基丙烯酸甲酯（MMA）、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）以及衣康酸（IA），參考楊文明[18]的方法，用Gaussian 09W中的Restricted Hartree-Fock（RHF）自洽場理論和NBO理論，在真空中，運用6-31G基組優(yōu)化模板分子、功能單體分子及兩者不同比例混合物的幾何結構，得到最低穩(wěn)定能量，以式（1）計算模板分子與各功能單體的結合能ΔE。

式中：

E——各組分的單點能，kJ/mol；

n——功能單體的數(shù)量。

1.2.2 致孔溶劑的篩選

選擇氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈和正己烷4種具有代表性的致孔溶劑。參考陳曉龍等[19]的方法，采用RHF方法，6-31G基組，極化連續(xù)溶劑模型（Polarizable continuum model，PCM），按式（2）計算溶劑化能。

式中：

ΔE致孔溶劑——體系的溶劑化能，kJ/mol；

EPCM——溶劑狀態(tài)下體系的單點能，kJ/mol；

EHF——真空狀況下體系的單點能，kJ/mol。

1.3 AMB與功能單體預聚體的核磁氫譜分析

參考Farrington等[17]的方法，將AMB、不同功能單體及AMB與不同功能單體形成的預聚體均用氘代氯仿溶解（濃度均為0.04 mol/L），經(jīng)Avance III HD 400 M核磁共振波譜儀測定核磁氫譜。

1.4 MIPs的制備

采用沉淀聚合法制備分子印跡聚合物[20]，稱取一定量AMB和功能單體分散于致孔溶劑中，攪拌1 h。加入一定量乙二醇二甲基丙烯酸酯和144.5 mg（0.88 mmol）偶氮二異丁腈，攪拌均勻后超聲10 min，充氮氣10 min，在60 ℃的磁力攪拌水浴鍋中密閉反應24 h。所得聚合物用甲醇-乙酸溶液（體積比9:1）洗脫，每30 min更換一次洗脫液直到檢測不到模板分子，用甲醇和蒸餾水除去乙酸，60 ℃真空干燥，得到的白色粉末狀聚合物即為MIPs。非印跡聚合物（non-imprinted polymers，NIPs）的制備與MIPs相同，但不加入模板分子。

1.5 正交試驗

根據(jù)對計算機模擬與波譜分析的研究結果以及單因素試驗結果，進一步采用L9（34）設計正交試驗，其因素和水平設計如表1所示。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design test

1.6 MIPs的結構表征

1.6.1 掃描電鏡檢測

用掃描電鏡對最優(yōu)條件下合成的MIPs以及NIPs進行形貌表征。將待測樣品均勻涂覆在導電膠上，采用離子濺射儀對MIPs噴金，然后在室溫下進行掃描電鏡測試。

1.6.2 比表面積與孔容孔徑參數(shù)測定

MIPs和NIPs的比表面積和孔容孔徑采用Gemini VII 2390分析儀測量。樣品在110 ℃下脫氣24 h后，采用氮吸附法進行參數(shù)測定[21]。

1.6.3 紅外光譜檢測

采用Vertex 70傅里葉變換紅外光譜儀對CBZ標準品、MIPs和吸附CBZ后MIPs的化學結構進行表征，采用溴化鉀壓片法，將樣品和KBr以1:100的質量比混合后研磨均勻，20 MPa壓力下壓片得到薄片進行波譜掃描，掃描波數(shù)范圍為4000～400 cm-1[22]。

1.6.4 熱重分析

采用Netzsch TG 209 F1 Libra熱重分析儀對MIPs和NIPs進行熱重分析。在氮氣保護下，將樣品以10 ℃/min的升溫速率和30 mL/min的氮氣流量從30加熱至600 ℃進行測試[23]。

1.7 MIPs吸附性能的測定

1.7.1 動態(tài)吸附曲線測定與吸附動力學分析

參考顏朦朦[24]的方法，分別稱取10 mg MIPs和NIPs，加入100 mg/L的CBZ標準品溶液10 mL，在室溫下，震蕩不同時間間隔（10～240 min）。離心（6000 r/min，10 min），測定上清液中CBZ的濃度。根據(jù)公式（3），計算其不同時間對應的吸附量。采用一級動力學反應模型公式（4）和二級動力學反應模型公式（5）對MIPs的動態(tài)識別機制進行深入探討。

式中：

Q——平衡時MIPs對分析物的吸附量，mg/g；

C0——分析物的初始濃度，mg/L；

Ce——分析物的上清液終濃度，mg/L；

V——加入吸附溶液的體積，L；

m——加入MIPs的質量，g。

一級動力學反應模型公式：

式中：

Qeq——MIPs的平衡吸附量，mg/g；

Qt——MIPs在不同時間下的吸附量，mg/g；

Q1cal——一級動力學模型理論吸附量，mg/g；

k1——一級動力學模型吸附速率常數(shù)；

t——吸附時間，min。

二級動力學反應模型公式：

式中：

Q2cal——二級動力學模型理論吸附量，mg/g；

k2——二級動力學模型吸附速率常數(shù)。

1.7.2 靜態(tài)吸附曲線測定與Scatchard分析

具體過程參照動態(tài)吸附實驗，根據(jù)1.7.1部分實驗結果固定吸附時間，CBZ的濃度設定為0.1～100 mg/L。根據(jù)公式（3）計算不同濃度對應的吸附量。通過公式（6）進行Scatchard方程分析[24]。

式中：

Qmax——最大表觀吸附量，mg/g；

KD——平衡常數(shù)。

1.7.3 苯并咪唑類殺菌劑廣譜吸附實驗

參考周劉梅[25]的方法，并稍作修改。稱取4份MIPs 10 mg，分別加入100 mg/L CBZ、噻菌靈、阿苯達唑和苯菌靈的標準溶液。于室溫下震蕩2 h后離心（6000 r/min）10 min，根據(jù)式（3）、（7）和（8）計算MIPs對各底物的靜態(tài)吸附量Q（mg/g）、靜態(tài)分配系數(shù)K和印跡因子IF。

式中：

Cp——底物結合在MIPs上的濃度，mg/L；

Cs——上清液中底物的濃度；mg/L。

式中：

KMIPs——MIPs的靜態(tài)分配系數(shù)；

KNIPs——NIPs的靜態(tài)分配系數(shù)。

1.8 MIPs固相萃取實驗

MIPs固相萃取柱的制備：參考陳曉龍[26]的方法，并稍作修改。稱取100 mg MIPs作為固相萃取填料置于柱體積為5 mL、底部有聚乙烯篩板的聚丙烯空柱中，作為MIPs固相萃取小柱。

加標石斛多糖提取液的制備：稱取3.0 g新鮮石斛，加入80 mL蒸餾水勻漿后沸水浴提取30 min，抽濾除去濾渣得到石斛多糖提取液。提取液中分別加入2.0 mg CBZ、噻菌靈、阿苯達唑和苯菌靈，加蒸餾水定容至200 mL。

MIPs固相萃取柱對農(nóng)藥的脫除：控制抽氣泵的壓力為15 MPa，用10 mL乙腈活化分子印跡填料，10 mL加標石斛多糖提取液上樣，再用10 mL正己烷淋洗，最后用10 mL甲醇-乙酸溶液（9:1，V/V）進行洗脫，分別收集上樣流出液、淋洗流出液和洗脫液，檢測上樣液與流出液中四種農(nóng)藥以及總糖的含量[27]，計算農(nóng)藥脫除率以及總糖損失率。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，并用Origin 9.1對數(shù)據(jù)進行制圖。顯著性水平p<0.05。

2 結果與分析

2.1 分子印跡預聚體的模擬篩選

2.1.1 功能單體種類及比例的篩選

分子印跡聚合過程中，模板分子與功能單體形成預聚體的結合能ΔE越低，表明它們的相互作用越大，形成的MIPs越穩(wěn)定[28]。AMB與各功能單體預聚體的最低能量構象見圖1，不同聚合體的結合能見表2。由表2可知，AMB與AA之間相互作用最強，MAA、IA次之。進一步選擇AA、MAA和IA，篩選它們與AMB的最適比例。結果如圖2所示，AMB-IA預聚體的結合能較AMB-MAA和AMB-AA而言最低，且在摩爾比為1:2時下降趨勢最為明顯，說明AMB-IA預聚體摩爾比為1:2時合成的MIPs較穩(wěn)定。

圖2 AMB與不同功能單體在不同比例下的結合能Fig.2 ΔE of AMB and different functional monomers at different ratios

表2 AMB、功能單體以及預聚體的結合能Table 2 ΔE of AMB, functional monomer and prepolymers

圖1 AMB與功能單體的最低能量構象Fig.1 Lowest energy conformation of AMB and functional monomer

2.1.2 致孔溶劑的篩選

AMB與MAA、AA和IA形成的預聚體在氯仿、N,N-二甲基甲酰胺、乙腈和正己烷這4種常用致孔溶劑中的溶劑化能如表3所示。其中，ΔE乙腈最高，表明乙腈與各預聚體的相互作用最小，有利于提供較好的聚合環(huán)境。

表3 AMB與功能單體復合物在不同溶劑中的溶劑化能Table 3 ΔE between AMB and functional monomer complex in different solvents

2.2 預聚體核磁氫譜分析

核磁共振譜圖中分子間相互作用的強弱反映在質子的化學位移變化上[29]。由圖3可知，AMB中3個質子（A、B和C）的峰位移大小為δAMB-IA>δAMB-AA>δAMB-MAA>δAMB-AAM>δAMB-MBA>δAMB-MMA。表明AMB與IA的相互作用最強，形成的預聚體最穩(wěn)定。這與計算機模擬結果相一致。FARRINGTON等[17]通過核磁共振分析法結合計算機分子模擬，篩選制備咖啡因MIPs的最適致孔溶劑、功能單體及比例。兩種預聚體篩選方法的結合有助于提高制備MIPs的效率，降低盲目性。

圖3 AMB與AMB-功能單體預聚體的核磁氫譜Fig.3 NMR spectra of AMB and AMB-functional monomer prepolymers

2.3 正交試驗結果

根據(jù)AMB與不同功能單體預聚體系的研究結果，選擇IA作為功能單體，乙腈作為致孔溶劑，固定AMB與IA的摩爾比為1:2。根據(jù)前人研究表明[18]，乙二醇二甲基丙烯酸甲酯（EGDMA）為常用交聯(lián)劑，由它制備出MIPs具有良好選擇性。此外，偶氮二異丁腈（AIBN）為常用引發(fā)劑，故將EGDMA作為交聯(lián)劑，AIBN作為引發(fā)劑，采用沉淀聚合法制備MIPs。

以MIPs對代表性的苯并咪唑類殺菌劑CBZ的吸附量為評價指標，對制備條件進行優(yōu)化。由單因素試驗結果可知，固定EGDMA用量為20 mmol，乙腈用量為50 mL時，AMB用量為1 mmol的條件下，MIPs的吸附量最大，為7.58 mg/g；固定AMB用量為1 mmol，乙腈用量為50 mL時，EGDMA用量為20 mmol的條件下，MIPs的吸附量最大，為8.47 mg/g；固定AMB用量為1 mmol，EGDMA用量為20 mmol時，乙腈用量為50 mL的條件下，MIPs的吸附量最大，為7.53 mg/g。

表5 正交試驗方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal design results

在單因素試驗基礎上，進一步通過正交試驗優(yōu)化MIPs的制備條件，結果如表4、5所示。由極差分析可知，最佳試驗組合是A2B2C2，各因素對MIPs吸附性能的影響由大到小為模板分子用量>致孔溶劑用量>交聯(lián)劑用量。方差分析也表明，模板分子和致孔溶劑的用量對MIPs的吸附性能具有顯著影響。李璐等[16]的研究表明，適量的模板分子有助于形成選擇性識別位點；但模板分子過量則易產(chǎn)生自身結締作用，增加非特異性識別位點。Cormack等[30]的研究表明致孔溶劑的用量不僅影響印跡效果，還影響MIPs的物理形態(tài)（如形貌狀態(tài)、機械強度等）。也有學者研究表明，交聯(lián)劑用量不足，會使印跡孔穴穩(wěn)定性下降，特異性吸附效率降低；交聯(lián)劑使用過量，會使模板分子難以洗脫，造成聚合物吸附量低[19]，而本試驗結果表明，交聯(lián)劑用量對MIPs的吸附性能沒有顯著影響。這可能是由于單因素試驗已把交聯(lián)劑用量縮小至合適范圍內，弱化了正交試驗中交聯(lián)劑用量對MIPs吸附性能的影響。

表4 正交試驗方案及結果Table 4 Results of orthogonal design

2.4 MIPs的表征

2.4.1 MIPs的微觀結構

MIPs和NIPs的掃描電鏡如圖4a和圖4b所示。MIPs表面疏松多孔，而NIPs團聚現(xiàn)象嚴重。MIPs的比表面積為203.40 m2/g，孔容為0.47 cm3/g，孔徑為23.11 nm；NIPs的比表面積為134.62 m2/g，孔容為0.37 cm3/g，孔徑為26.59 nm。MIPs的孔徑小于NIPs，但具有更大的比表面積和孔容，這使MIPs比NIPs具有更好的特異性吸附能力[31]。

圖4 聚合物的形貌表征Fig.4 Characterization of the polymers

2.4.2 傅里葉紅外光譜分析

由圖4c可知。CBZ中仲酰胺的特征吸收峰分別在3322、1630和1595 cm-1處。吸附CBZ后的MIPs在1595 cm-1處有仲胺-NH的伸縮振動，表明CBZ被成功吸附在MIPs上。MIPs和吸附CBZ后的MIPs的譜圖上均有IA結構中3564和3453 cm-1處C=C的特征吸收峰，2990和2957 cm-1處C-H的特征吸收峰以及1730 cm-1處C=O的特征吸收峰，表明功能單體IA成功接枝在了MIPs上。

2.4.3 熱重分析

由圖4d可知，當溫度低于240 ℃時，MIPs與NIPs沒有明顯的質量損失。表明MIPs有良好的熱穩(wěn)定性，對應用環(huán)境具有較好的耐受性。

2.5 MIPs的吸附性能

2.5.1 動態(tài)吸附實驗及動力學分析

由圖5a可知，MIPs對CBZ的吸附量在120 min內達到平衡。因此，后續(xù)實驗中MIPs的吸附時間為120 min。靜態(tài)平衡吸附量Q為8.87 mg/g，明顯高于Farooq等[12]以β-環(huán)糊精作為功能單體，二甲基亞砜為致孔溶劑合成的MIPs對CBZ的吸附量3.65 mg/g以及Raif等[13]以甲基丙烯酸為功能單體，N,N-二甲基甲酰胺為致孔溶劑合成的MIPs對CBZ的吸附量2.31±0.63 mg/g。其原因可能是合成MIPs所選的功能單體和溶劑的種類及用量不同，合成的MIPs上特異性識別位點和數(shù)量上有差異，導致吸附量的明顯差異。由圖5b和圖5c可知，準二級動力學方程的R22遠高于準一級動力學方程的R12，理論吸附量分別為Q1cal=2.27 mg/g，Q2cal=8.58 mg/g。二級動力學模型的理論吸附量Q2cal更接近于實驗值，說明MIPs對CBZ的吸附過程更符合二級動力學模型。

圖5 聚合物的吸附性能Fig.5 Adsorption properties of polymers

2.5.2 靜態(tài)吸附實驗及Scatchard分析

由圖5d可知，MIPs相對于NIPs對CBZ有更好的吸附性。Scatchard分析如圖5e所示，Q/Ce對Q并不存在線性關系，但兩端可擬合出較好的線性。有學者推測左端直線可能代表高特異性、高親和力結合位點，右端直線可能代表低親和力、低選擇性結合位點[24]。對兩端線性部分進行擬合，得到的解離常數(shù)分別為KD1=3.40 mg/L和KD2=28.60 mg/L，對應的最大表觀吸附量分別為Qmax1=4.18 mg/g和Qmax2=14.00 mg/g。

2.5.3 MIPs的選擇性吸附

MIPs和NIPs對所選的苯并咪唑類殺菌劑CBZ、噻菌靈、阿苯達唑和苯菌靈的靜態(tài)吸附量如圖5f所示。Q多菌靈=8.87 mg/g、Q噻菌靈=5.89 mg/g、Q阿苯達唑=6.26 mg/g、Q苯菌靈=7.06 mg/g。說明MIPs除了對CBZ有較高的吸附性，對苯并咪唑結構類似物也具有較好的吸附廣譜性。此外，MIPs對各底物的印跡因子分別為IF多菌靈=2.89、IF噻菌靈=2.29、IF阿苯達唑=1.93、IF苯菌靈=2.59，表明對苯并咪唑類殺菌劑而言，MIPs相比于NIPs有明顯的印跡效果。

2.6 MIPs的固相萃取

石斛是一種藥食同源的蘭科植物，其多糖含量較高，是石斛藥理學活性的主要作用因子[32]。多菌靈是石斛種植過程中使用最多的農(nóng)藥之一[33]。因此，使用加標石斛多糖提取液作為樣液，檢測MIPs固相萃取柱對加標石斛多糖提取液中四種苯并咪唑類殺菌劑的脫除率以及總糖的脫除率（損失率）。結果如圖6所示，MIPs固相萃取柱對四種殺菌劑均有較好的脫除效果，脫除率分別為CBZ 98.46%、噻菌靈95.03%、阿苯達唑92.10%以及苯菌靈96.31%。此外，對加標石斛多糖提取液中總糖的脫除率（損失率）為14.94%。表明MIPs作為固相萃取的吸附填料，可以有效地脫除石斛水提液中苯并咪唑類殺菌劑，而對其總糖的損失較小。

3 結論

3.1 與AMB相互作用最強的功能單體是IA，AMB與IA最適的摩爾比為1:2，對預聚體影響最小的致孔劑為乙腈。通過Gaussian軟件模擬和核磁氫譜進行預聚體系篩選為MIPs合成提供科學指導，縮短了試錯周期，降低了試錯成本。

3.2 模板分子和致孔劑的用量對合成的MIPs的吸附性能有顯著影響，合成MIPs的最佳制備條件為AMB用量1 mmol，交聯(lián)劑用量20 mmol，乙腈用量50 mL。該條件下制備的MIPs吸附能力最強。

3.3 制備的MIPs動態(tài)吸附平衡時間為120 min，吸附過程符合二級動力學反應模型。對CBZ的靜態(tài)平衡吸附量Q為8.87 mg/g，印跡因子IF為2.89。MIPs不僅對CBZ具有良好的特異性吸附能力，對其它苯并咪唑類殺菌劑噻菌靈、阿苯達唑和苯菌靈也具有較好的吸附廣譜性。故可進一步將其作為脫除苯并咪唑類農(nóng)藥殘留的吸附填料。

3.4 以MIPs作為填料的固相萃取柱，對加標石斛多糖提取液中四種苯并咪唑類殺菌劑具有較好的脫除效果，脫除率均達92%以上，且對多糖類活性物質影響較小（總糖損失為14.94%）。