牛亞春，藍東明，王永華，楊博*

（1.華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006）（2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）

具有特異性底物專一性的生物酶在工業(yè)領域中具有重要的應用價值。與常見的甘油三酯水解酶（EC 3.1.1.3）不同[1-3]，甘油單酯脂肪酶（monoacylglycerol lipases，EC 3.1.1.23）能專一地作用于甘油單酯，將其水解成脂肪酸和甘油[4]。由于其高度專一的底物特異性，可應用于合成高純度甘油二酯[5]或者甘油單酯[6]，而甘油單酯是重要的乳化劑、穩(wěn)定劑、藥品添加劑及防腐劑等[7,8]。另外，甘油單酯脂肪酶在人體中具有重要的生理調控作用，如介導2-花生四烯酸甘油酯（2-AG）信號傳導和花生四烯酸代謝[9,10]，是重要的藥物研發(fā)靶蛋白。

微生物來源的甘油單酯脂肪酶具有顯著的耐熱性能及催化活力，更具有工業(yè)應用潛力，其發(fā)掘及結構功能的研究一直是熱點。Imamural等[4]對來源于Bacillussp. H-257的甘油單酯脂肪酶MGLP的酶學性質進行了研究，結果表明其最適反應溫度為75 ℃，最適pH 6～8；Riegler-Berket等[11]研究了來源于Arabidopsis thaliana的甘油單酯脂肪酶AtMAGL的底物特異性、區(qū)域特異性及脂肪酸特異性；Kim等[12]研究了甘油單酯脂肪酶MGL的蓋子結構及功能關系；隨后，唐薇[13]對來源于Geobacillussp.12AMOR1的甘油單酯脂肪酶GMGL進行克隆表達，首次解析了海洋微生物來源的甘油單酯脂肪酶的晶體結構，并研究了GMGL識別及水解底物的過程。

固定化酶是提高游離酶應用性能的有效方法之一，如提升生物酶的穩(wěn)定性，延長使用壽命及生產成本低等優(yōu)點[14-16]。常見的固定化方法主要包括吸附法、包埋法、共價結合法、交聯法和熱處理法等，其中吸附法是通過疏水相互作用、范德華力等物理相互作用力，將酶分子和樹脂相互結合，使用此類結合方法常見的樹脂有大孔吸附樹脂，但其固定后的酶分子易脫落，性能不穩(wěn)定，影響固定化酶的重復利用。因此，為解決大孔吸附樹脂所固定的酶使用壽命短的問題，尋找一種新的樹脂用于固定化很有意義。ECR8285樹脂是一種環(huán)氧丙烯酸酯樹脂，主要通過共價結合作用使酶分子表面上的非必需基團與載體材料表面上的活性官能團實現多點共價結合，與大孔吸附樹脂相比，該方法獲得的固定化酶具有更高的固定化效率及較長的使用壽命。Li等[17,18]通過共價結合方法將偏甘油酯脂肪酶SMG1-F278N固定在ECR8285樹脂，與游離脂肪酶相比，固定化SMG1-F278N的熱穩(wěn)定性顯著提高，重復使用7次后催化活力保留率仍為98.00%。由此可見，ECR8285樹脂由于其牢固的共價結合方式用于固定化酶載體具有潛在的應用價值。

目前，甘油單酯脂肪酶的研究主要集中在基因挖掘、酶學性質表征及晶體結構與功能的關系等[11,12]，但已報道的甘油單酯脂肪酶產量低，難以滿足產業(yè)化生產需求及游離酶無法重復利用等缺點，且迄今為止關于重組甘油單酯脂肪酶高效表達的發(fā)酵條件優(yōu)化又尚未報道。因此，為降低產業(yè)化成本，提高經濟效益，本研究以甘油單酯脂肪酶GMGL重組大腸桿菌為研究對象，在5 L發(fā)酵罐中研究了誘導時間、誘導溫度、誘導pH以及葡萄糖補料方式對重組工程菌表達甘油單酯脂肪酶的影響，并以環(huán)氧樹脂ECR8285為固定化材料，研究了酶載量、緩沖鹽濃度以及緩沖液pH對GMGL固定化的影響。研究結果為后期甘油單酯脂肪酶的高效表達和固定化酶制備提供研究基礎，以期獲得生物化工和食品化工領域應用的甘油單酯脂肪酶固定化酶制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與質粒

重組大腸桿菌表達菌株pET30a-GMGL/BL21（DE3）由華南理工大學生物化工實驗室構建和保藏。

1.1.2 生化試劑

酵母粉、蛋白胨、一水葡萄糖、卡那霉素等購自國藥集團；單硬脂酸甘油酯（MAG）購自上海麥克林試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器設備

生化培養(yǎng)箱，重慶市永生試驗儀器廠；DYY-8C型電泳儀，北京市六一儀器廠；SKY2102C型搖床，SUKUN；全自動凝膠成像儀，BIO-RAD；5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設備工程有限公司；SBA-40D生物傳感儀，山東省科學院生物研究所；Merlin型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，Zeiss；Nicolet IS50-Nicolet Continuum型傅里葉變換紅外光譜儀-紅外顯微鏡，Thermo Fisher Scientific。

1.1.4 培養(yǎng)基

搖瓶種子液培養(yǎng)基（L-1）：10 g胰蛋白胨，5 g酵母粉，10 g NaCl，補加終濃度為50 μg/mL的卡那霉素。

發(fā)酵培養(yǎng)基（L-1）：10 g一水葡萄糖，11.5 g酵母膏，19.5 g蛋白胨，4 g (NH4)2SO4，0.9 g檸檬酸，18 g K2HPO4·3H2O，3 g KH2PO4，1.2 g MgSO4（單獨滅菌），微量元素液1 mL。

微量元素溶液（L-1）：2.8 g FeSO4·7H2O，2 g MnCl2·4H2O，2.8 g CoSO4·7H2O，1.5 g CaCl2·2H2O，0.2 g CuCl2·2H2O，0.3 g ZnSO4·7H2O，溶于1 mol/L HCl中。

補料培養(yǎng)基（L-1）：600 g葡萄糖，10 g MgSO4·7H2O。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子液制備

凍存的重組大腸桿菌在LB固體培養(yǎng)基上（含卡那霉素50 μg/mL）37 ℃劃線，培養(yǎng)12～18 h。接種單菌落到5 mL LB培養(yǎng)液中，培養(yǎng)溫度37 ℃、轉速200 r/min的條件培養(yǎng)12～14 h；將上述培養(yǎng)物按1%的接種量加到150 mL LB培養(yǎng)液中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至對數生長中后期，OD600=2～6左右。

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件

5 L發(fā)酵罐中裝液量為3 L，接種量5%，發(fā)酵培養(yǎng)溫度37 ℃，通過調節(jié)攪拌轉速和空氣流速使溶氧不低于10%，流加氨水控制pH 7.0左右。分批培養(yǎng)4 h后，進行補料培養(yǎng)，葡萄糖流加速度為12.5 g/h。在對數生長期對細胞進行誘導，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為1 mmol/L，27 h時停止補料，31 h時停止發(fā)酵。誘導階段每4 h取樣，測定細胞濕重、酶活、葡萄糖殘留含量。誘導時間設置為對數生長前期（2 h）、對數生長中期（4 h）和對數生長后期（7 h）；誘導溫度設置為25 ℃、30 ℃和35 ℃；誘導pH設置為6.5、7.0和7.5。

葡萄糖流加方式分別設定為恒速流加、變速流加、指數流加和pH-STAT。（1）恒速流加葡萄糖流速為12.5 g/h；（2）變速流加控制發(fā)酵液中葡萄糖含量低于5 g/L；（3）指數流加控制比生長速率為0.065 h-1；（4）pH-STAT串聯pH和補料，當pH低于7.0時流加葡萄糖。

1.2.3 GMGL酶活力檢測

取15 mL發(fā)酵液離心去上清，菌體用15 mL pH 7.5的10 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液重懸菌體，超聲破壁15 min，離心所得上清即為GMGL粗酶液。GMGL酶活力測定參見唐微等的方法[13]并加以修改。取4 g乳化液（4%的聚乙烯醇(PVA):MAG體積比為3:1）加入5 mL pH 7.5磷酸鹽緩沖液，空白對照中加入15 mL 95%的乙醇，于150 r/min，60 ℃搖床中預熱5 min，預熱后加入1 mL稀釋適當倍數的酶液，然后反應10 min。待反應結束后立即加入15 mL 95%的乙醇終止反應。反應結束后加入2滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定。在一定反應條件下，每分鐘催化底物水解生成1 μmol脂肪酸所需要的酶量定義為1 U。

1.2.4 發(fā)酵液中葡萄糖含量測定

用SBA-40D生物傳感儀測定發(fā)酵液中葡萄糖含量。

1.2.5 GMGL的固定化

將粗酶液濃縮至5000 U/mL，取部分酶液與樹脂ECR8285按不同固定化條件進行混合，25 ℃固定時間為8 h。真空泵除去吸附后殘液，將待干燥固定化酶置于35 ℃真空干燥箱干燥8 h，控制水分含量在5%以下，4 ℃儲存?zhèn)溆谩９潭ɑ瘲l件：（1）酶載量為50、100、150、200和250 mg/g；（2）緩沖液鹽濃度為0.05、0.10、0.30、0.50和1.00 mol/L；（3）緩沖液pH為5、6、7、8、9和10。

1.2.6 固定化GMGL的表征

1.2.6.1 固定化酶GMGL的SEM表征

根據Liu等[19]的方法，利用SEM研究GMGL固定前后環(huán)氧樹脂ECR8285的表面形貌。

1.2.6.2 固定化酶GMGL的FT-IR表征

FT-IR光譜檢測參照Liu等[19]的方法。

1.2.7 固定化酶GMGL的蛋白吸附量測定

蛋白吸附量測定方法參考文獻[17]。

1.2.8 固定化酶水解活力測定方法

固定化GMGL酶活力測定參見唐微等[13]方法并加以修改。取4 g已制備好的乳化劑（4%的PVA：單硬脂酸甘油酯體積比為3:1）加入5 mL pH 7.5磷酸鹽緩沖液，空白對照中加入15 mL 95%乙醇，設定轉速為150 r/min，溫度為60 ℃搖床中預熱5 min，預熱后加入0.01 g固定化GMGL，然后反應10 min。待反應結束后立即加入15 mL 95%的乙醇終止反應。反應結束后加入2滴酚酞指示劑，用0.05 mol/L NaOH溶液滴定。

1.2.9 數據處理

以上每項檢測指標均設置三個平行。用Microsoft Excel 2010軟件計算所有數據的平均值和標準差，采用Origin 2021軟件作圖，SPSS 9.0進行分析，顯著性水平p<0.05。

2 結果與討論

2.1 重組大腸桿菌高效表達GMGL的發(fā)酵條件優(yōu)化

2.1.1 誘導時間對重組大腸桿菌表達GMGL的影響

lac啟動子是一種常用的由乳糖或其類似物異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導表達的啟動子，誘導劑IPTG在不同的生長時期進行誘導，對目的基因的表達會產生顯著性差異。Sriubolmas等[20]采用大腸桿菌DH5α（pQEA11）生產青霉素?；笗r，在對數生長初期和中期進行誘導時，青霉素酰化酶的表達量不高，但在對數生長中后期進行誘導時，青霉素?；傅谋磉_量顯著提高。因此，分別在對數生長前期、中期和后期添加IPTG進行誘導，探究不同誘導時間對重組大腸桿菌發(fā)酵表達水平的影響。如圖1c，在對數生長前期和中期進行誘導，菌體生長情況受到影響，最大細胞濕重只能達到99.88 g/L，可能是由于細胞較早地開始合成GMGL，從而給菌體后期的生長帶來壓力，提前誘導會導致發(fā)酵液中的葡萄糖提前積累。如圖1a和1b，對數生長后期誘導更有利于細胞的生長和產物的合成，同時提高了細胞對葡萄糖的利用率，發(fā)酵31 h時，酶活力達到1550 U/mL，比對數生長前期誘導提高了30.80%，比對數生長中期誘導提高了21.40%。這一結果表明在對數生長后期開始誘導，有利于GMGL的表達，為探究誘導時間對其他重組蛋白表達的影響提供良好的借鑒。

圖1 誘導時間對重組大腸桿菌發(fā)酵過程的影響Fig.1 Effect of induction time on the fermentation process of recombinant E. coli

2.1.2 誘導溫度對重組大腸桿菌表達GMGL的影響

誘導溫度是影響菌體生長和調控產物合成的重要因素。丁蘭寶等[21]報道較高的誘導溫度有利于大腸桿菌的高密度發(fā)酵，但低溫誘導能提高目的產物的合成，而且在不同培養(yǎng)階段采用不同的培養(yǎng)溫度有利于提高大腸桿菌的生長密度和重組產物的表達量，可縮短發(fā)酵周期。此外，一些研究表明，培養(yǎng)溫度的升高會導致工程菌的質粒穩(wěn)定性變差，造成質粒丟失。本研究生探究了不同誘導溫度對重組大腸桿菌產GMGL的影響，如圖2c，在35 ℃條件下誘導，發(fā)酵19 h時，細胞濕重達到最高125.40 g/L，之后細胞濕重開始下降，23 h時發(fā)酵液中開始積累葡萄糖，27 h時殘?zhí)橇窟_到最高2.40 g/L，酶活達到最高1233 U/mL。在30 ℃的誘導溫度下，發(fā)酵23 h時，細胞濕重達到最高123.98 g/L。如圖2a和2b，隨后發(fā)酵液中的葡萄糖大量積累，細胞濕重和酶活力開始下降，31 h時酶活力為1075 U/mL。在25 ℃的誘導溫度下，發(fā)酵19 h時細胞濕重開始下降，但酶活力繼續(xù)增加，發(fā)酵31 h時達到最高1550 U/mL，比30 ℃和35 ℃分別提高了44.19%和29.38%，說明低溫更有利于甘油單酯脂肪酶活力的提高。這一現象在其他研究中也有報道[22]，推測一是低溫有利于外源蛋白質的有效折疊；二是在低溫條件下，乙酸等代謝產物的積累減少，降低了細胞生長過程中的毒害作用。

圖2 誘導溫度對重組大腸桿菌發(fā)酵過程的影響Fig.2 Effect of induction temperature on the fermentation process of recombinant E. coli

2.1.3 誘導pH對重組大腸桿菌表達GMGL的影響

發(fā)酵過程中維持穩(wěn)定的pH是使細胞保持最佳生理狀態(tài)的必要條件。一方面，外界pH值的變化會通過弱酸或弱堿的變化改變細胞內的pH，從而影響細胞的生理代謝。另一方面，大腸桿菌利用碳源產生的代謝產物即有機酸的積累，會造成pH值的下降；而有機酸的消耗，以及無機氮源的利用，則會造成pH值上升。在發(fā)酵過程中，通過流加低濃度的堿對pH進行調節(jié)，進而控制發(fā)酵液的pH處于適宜的范圍內，可以避免pH值的劇烈變化對細胞生長和代謝造成不利影響。分別控制誘導pH為6.5、7.0和7.5，探究了不同恒定pH發(fā)酵條件下對甘油單酯脂肪酶重組表達的影響。如圖3b和3c，在pH 7.5條件下誘導更有利于細胞的生長，發(fā)酵6～23 h時GMGL酶活力更高，發(fā)酵31 h時酶活為1485 U/mL。在pH 7.0條件下誘導，相比pH 6.5和pH 7.5，27 h時發(fā)酵液中葡萄糖積累量最小為2.05 g/L，且甘油單酯脂肪酶關于葡萄糖的得率最高。如圖3a，在pH 6.5條件下誘導時，細胞生長較緩慢，隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中殘?zhí)橇恐饾u增加，27 h時殘?zhí)橇孔罡邽?.84 g/L，發(fā)酵31 h時GMGL酶活力達到1298 U/mL。結果表明，不同誘導pH對細胞生長影響不大，但pH 7.0更有利于甘油單酯脂肪酶的合成。因此，研究誘導pH對重組蛋白的表達具有重要意義。

圖3 誘導pH對重組大腸桿菌發(fā)酵過程的影響Fig.3 Effect of induction pH on the fermentation process of recombinant E. coli

2.1.4 葡萄糖流加方式對重組大腸桿菌表達GMGL的影響

大腸桿菌在過量葡萄糖或缺氧的條件下會發(fā)生葡萄糖效應，積累大量有機酸而影響重組菌的生長和外源蛋白的高效表達[23]。大腸桿菌高密度發(fā)酵中，葡萄糖的合理流加方式是關鍵的影響因素。分別研究了恒速流加補料、變速補料、指數補料和pH-STAT等4種方式對重組酶表達的影響。如圖4c，恒速流加條件下，細胞生長較快，發(fā)酵19 h時達到116.75 g/L，由于誘導前期葡萄糖流加速度過快，細胞代謝過快喪失活力，19 h后細胞衰老死亡。變速流加條件下，控制發(fā)酵液中葡萄糖殘留含量低于5 g/L，限制性地流加葡萄糖，隨著發(fā)酵時間的延長，酶活力逐漸增加，31 h時達到最高1985 U/mL（圖4b），重組蛋白的表達量隨發(fā)酵時間的變化見4d，蛋白分子量與唐薇[13]預測大小一致，約為28 ku。指數流加條件下，4～19 h細胞能按照恒定比生長速率0.065 h-1生長，但由于發(fā)酵液中葡萄糖大量積累，19 h后細胞大量死亡，發(fā)酵31 h時酶活達到1255 U/mL。一般來說，細菌比生長速率高乙酸的比生成率就高，當重組菌的生長速率超過某個臨界值便產生乙酸[24]，指數流加結果表明，降低該重組大腸桿菌的比生長速率有利于甘油單酯脂肪酶的合成。如圖4a，pH-STAT流加條件下，發(fā)酵液中葡萄糖含量一直維持在較低水平，且細胞生長緩慢，可能碳源不足，發(fā)酵31 h酶活達到1420 U/mL。大腸桿菌代謝葡萄糖產生的有機酸會導致發(fā)酵液中pH的降低，pH的下降在一定程度上反映了細胞對葡萄糖的需求，因此通過pH變化調節(jié)葡萄糖流加速率可以有效避免葡萄糖和乙酸的積累，但該方法的缺點就是pH的變化相對比較滯后，往往細胞已經處于饑餓狀態(tài)[25]。

圖4 葡萄糖流加方式對重組大腸桿菌發(fā)酵過程的影響及GMGL的SDS-PAGE檢測Fig.4 Effect of glucose feeding on the fermentation process of recombinant E. coli and SDS-PAGE test results of GMGL

2.2 重組甘油單酯脂肪酶GMGL的固定化

2.2.1 酶載量對GMGL固定化的影響

本實驗探究了酶載量對GMGL固定化的影響，結果如圖5所示，當酶載量小于100 mg/g時，蛋白吸附量隨著酶載量的增加而增加；當酶載量為100 mg/g時，固定化GMGL活力最高為2735 U/g，比活力為32.35 U/mg，蛋白吸附量為84.55 mg/g；當酶載量大于100 mg/g樹脂時，蛋白吸附量不會隨著酶載量的增加而增大而是逐漸趨于穩(wěn)定的趨勢，說明ECR8285樹脂對GMGL的吸附量達到飽和狀態(tài)。Li等[17]研究發(fā)現ECR8285樹脂對SMG1-F278N的吸附量也存在一個飽和臨界值，為30 mg/g。以上結果表明樹脂對酶的吸附都存在一個飽和臨界值。酶加量超過這個臨界值，在固定化過程中會造成酶原料的浪費，額外增加生產成本。因此，研究酶載量對GMGL固定化的影響，對實現固定化GMGL的低成本的工業(yè)化生產具有重要意義。

圖5 酶載量對GMGL固定化的影響Fig.5 Effect of lipase/support ratio on the immobilization of GMGL

2.2.2 緩沖液離子強度對GMGL固定化的影響

離子強度影響酶在載體疏水表面的物理吸附。本實驗探究了不同離子強度對固定化GMGL活力、比活力及蛋白吸附量的影響，結果如圖6所示，在離子強度為0.50 mol/L時，酶活力達到2925 U/g，比活力為39.63 U/mg，蛋白吸附量為73.79 mg/g，相比低離子強度條件下（0.05 mol/L）酶活力提高了181.25%，這表明GMGL固定化最適的離子強度是0.50 mol/L，Li等[17]通過提高鹽離子強度使固定化SMG1-F278N的酶活力提高了275.00%。這些結果表明提高鹽離子強度有助于固定化酶活力的提高。分析原因是高離子強度緩沖液有利于酶與載體的疏水表面發(fā)生吸附，進一步有助于載體的環(huán)氧基團與酶的氨基或巰基發(fā)生反應，形成非常穩(wěn)定的共價鍵，提高酶的有效吸附率[26]。這一研究結果為后期環(huán)氧樹脂做固定化材料提供合適的緩沖液離子強度參考值，具有重要意義。

圖6 緩沖液離子強度對GMGL固定化的影響Fig.6 Effect of buffer ionic strength on the immobilization of GMGL

2.2.3 緩沖液pH對GMGL固定化的影響

緩沖液的pH值是影響固定化酶活力的關鍵因素，因為它會影響酶的活性構象和結構[17]。因此，本實驗探究了不同pH對GMGL固定化的影響，結果如圖7所示，GMGL固定化最適緩沖液pH為9，固定化GMGL活力為4770 U/g，較pH 5提高了189.09%。不同緩沖溶液pH值的蛋白吸附量幾乎一致，但比活力和酶活力都先增加后減小。這一結果與Harris等[27,28]報道一致，表明酶活性中心的解離基團隨固定化體系pH值的變化而變化，從而影響固定化酶的活性。因此，選用酶載量為100 mg/g、緩沖液離子強度為0.50 M和緩沖液pH為9的條件，用于制備固定化GMGL的工藝，為甘油單酯脂肪酶的固定化研究提供了理論依據。

圖7 緩沖液pH對GMGL固定化的影響Fig.7 Effect of initial pH of buffer on the immobilization of GMGL

2.3 固定化GMGL的表征

2.3.1 固定化GMGL的SEM表征和FT-IR表征

利用SEM對環(huán)氧樹脂ECR8285，固定化GMGL及游離GMGL進行比較分析。由圖8可見，環(huán)氧樹脂ECR8285表面較光滑，而固定GMGL之后，其表面有明顯凸起附著物，表明GMGL酶分子與環(huán)氧樹脂ECR8285成功結合[29,30]。進一步利用FT-IR進行表征分析（圖9），固定化GMGL和游離GMGL分別在1562.34 cm-1和1631.77 cm-1出現蛋白質特有的一級結構中-NH-鍵的吸收峰，而在ECR8285樹脂紅外光譜中未發(fā)現-NH-鍵的吸收峰，再次表明游離GMGL已成功固定在ECR8285樹脂上。

圖8 ECR8285(a)、固定化GMGL(b,c)和游離GMGL(d)電鏡圖 Fig.8 Scanning electron micrographs of surface of resin ECR8285 (a)，immobilized GMGL (b,c) and free GMGL (d)

圖9 游離GMGL、固定化GMGL和ECR8285樹脂的FT-IR圖譜Fig.9 FT-IR spectra of free GMGL, immobilized GMGL and resin ECR8285

3 結論

本研究在5 L發(fā)酵罐體系中探究了不同誘導時間、溫度、pH和葡萄糖補料方式對重組大腸桿菌生長和甘油單酯脂肪酶GMGL合成的影響。確定了最佳發(fā)酵條件為重組大腸桿菌在25 ℃，pH 7.0，對數生長后期進行誘導，葡萄糖流加方式為變速流加，優(yōu)化后甘油單酯脂肪酶酶活力達到1985 U/mL，較優(yōu)化前提高了67.50%。通過共價結合的方式將GMGL固定到環(huán)氧樹脂ECR8285上，對GMGL進行固定化研究，確定最佳固定化條件為酶載量為100 mg/g，磷酸鹽緩沖液離子強度為0.50 M，pH為9，優(yōu)化后固定化酶GMGL活力為4770 U/g，較優(yōu)化前提高了189.09%。利用掃描電鏡（SEM）和傅里葉紅外光譜（FT-IR）進行表征，證實GMGL成功負載在ECR8285上。本研究首次將甘油單酯脂肪酶成功固定在ECR8285上，豐富了固定化酶制劑種類，優(yōu)化結果也為甘油單酯脂肪酶固定化酶的工業(yè)化生產及應用提供了一種新策略。