何洋，周靜，陳薇，張跡，沈婷，馮作山，胡衛(wèi)成*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學,食品科學與藥學學院，新疆烏魯木齊 830052）（2.淮陰師范學院,江蘇省高校區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇淮安 223300）

小麥種植范圍廣泛，我國是世界小麥主產(chǎn)國之一，2019年我國小麥產(chǎn)量為1.33×108t。小麥生產(chǎn)加工中的主要副產(chǎn)物，麩皮的出品率一般為小麥的15%～25%，年產(chǎn)量可達2.00×107t左右[1,2]。小麥麩皮含有豐富的脂肪酸、生育酚、膳食纖維以及酚類化合物。目前85%以上的小麥麩皮用作釀造和飼料生產(chǎn)的廉價原料，很少用于深加工，經(jīng)濟價值不高[1,3]。膳食纖維以多糖的形式存在于植物的細胞壁中，小麥麩皮中的多糖主要為阿拉伯木聚糖（Arabinoxylans，AX），約占麩皮組成的20%。

多糖是植物的次生代謝產(chǎn)物，具有很多生物活性，而多糖的生物活性與其單糖組成、糖苷鍵的連接方式、官能團、分子量、分支度等有關[4-6]。AX是一種半纖維素多聚糖，由阿拉伯糖和木糖組成，是植物細胞壁的主要成分之一，主要存在麥類、谷物及其麩糠中。AX具有諸多生物活性，如潤腸通便、降低膽固醇、調(diào)節(jié)血糖、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等[7-9]。近年來，通過攝取食物和食物來源的物質(zhì)來增強免疫力已被廣泛研究，AX在機體免疫調(diào)節(jié)方面已有一些研究報道，不同來源以及不同提取方式獲得的AX均具有免疫調(diào)節(jié)活性。在日本，米糠中提取的AX作為免疫刺激劑已經(jīng)上市。Zhou等[10]發(fā)現(xiàn)口服木聚糖酶和堿液提取的小麥麩皮AX對BALB/c小鼠的先天性免疫和適應性免疫都有調(diào)節(jié)作用；Cao等[11]報道AX可以通過增加S180肉瘤小鼠的胸腺指數(shù)和T、B淋巴細胞的數(shù)量來抑制腫瘤的生長；Akhtar等[12]發(fā)現(xiàn)堿液提取的AX對患有球蟲病的雞體液免疫功能具有增強作用，顯著提高血清中IgS、IgG和IgM抗體水平。

免疫系統(tǒng)是一個由分子、細胞和器官構成的復雜網(wǎng)絡，它們相互作用和交流，以防御病原體的入侵，維持機體的穩(wěn)態(tài)[13]。免疫系統(tǒng)的性能對于保護機體免受病原體的侵害至關重要，它在維持健康平衡中發(fā)揮著重要的作用[14]。多糖可以直接或間接與免疫系統(tǒng)相互作用，觸發(fā)多種細胞、分子活動，激活免疫系統(tǒng)，單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞是作出反應的主要靶點[15]。單核細胞從血液遷移到組織中分化成巨噬細胞，巨噬細胞廣泛分布于全身，在宿主體內(nèi)平衡和抵御病原性感染中發(fā)揮著重要作用。與傳代細胞相比，原代細胞的形態(tài)結(jié)構和功能活動更接近體內(nèi)組織，更適用于研究細胞的生長、分化、代謝及其生理、病理變化[16,17]。在外界因素的刺激下，巨噬細胞可以被激活，從而產(chǎn)生各種細胞因子、干擾素和趨化因子，最終刺激宿主的免疫系統(tǒng)[18]。

目前關于小麥麩皮AX的研究大部分都是基于動物實驗，基于原代細胞信號轉(zhuǎn)導調(diào)節(jié)的研究較少。因此，在本研究中，進一步揭示AX的免疫功能及其機制，我們研究了AX對小鼠腹腔巨噬細胞活力、一氧化氮（NO）產(chǎn)生、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、白介素1β（IL-1β）、白介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和核轉(zhuǎn)錄因子（Nfkbia）的mRNA水平的影響，以及對MAPK和Akt信號通路的影響也進行了分析。這些結(jié)果將為AX作為免疫調(diào)節(jié)劑的開發(fā)提供理論依據(jù)，提高小麥加工副產(chǎn)物的綜合利用水平，為小麥麩皮的綜合利用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿拉伯木聚糖（AX），水提醇沉法提取于“淮麥33號”小麥麩皮，Sevage法除蛋白，經(jīng)DEAE 52和Sephadex-G100色譜柱分離純化，透析除去單糖后凍干。RPMI1640培養(yǎng)基，美國Gibco公司；臺盼藍、脂多糖（LPS）、甲氮甲唑藍（MTT）、對氨基苯磺酰胺、亞硝酸鈉（NaNO2）、N-1-萘乙胺鹽酸鹽，美國Sigma公司；PVDF膜（0.2 μm），美國Bio-Rad公司；抗體p-Akt、p-ERK、p-JNK、p-p38、Akt、ERK、JNK、p38，美國CST公司；山羊抗兔IgG（HRP）、山羊抗鼠IgG（HRP），美國Abcam公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Thermo公司；Trizol試劑，美國Ambion公司；30% Acr-Bis（29:1）、2×Taq Mastermix、β-actin抗體、化學發(fā)光檢測試劑盒，北京cwbio公司；異丙醇、甲醇、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷、甲醛、氯化鈉、三氯甲烷、乙醇等，上海國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HERA cell 150i型CO2細胞培養(yǎng)箱、MSC 1.2型超凈工作臺，美國Thermo公司；JY88-IIN型細胞超聲破碎儀，寧波新芝生物科技公司；Mix Mate混勻儀、5415R型小型高速離心機、5810R型臺式離心機，德國Eppendorf公司；Infinite 200 pro型酶標儀，瑞士Tecan公司；GEL-DOC-XR型凝膠成像系統(tǒng)、T100型PCR儀，美國BIO-RAD公司；FE20型pH計，上海Mettler Toledo公司；AE31型倒置生物顯微鏡，廈門Motic公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞的培養(yǎng)

小鼠腹腔巨噬細胞分離于SPF級ICR小鼠腹腔[16]，生長于含有10%胎牛血清、1%（V/V）青霉素和鏈霉素的RPMI medium 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)在37 ℃，濕潤的含有5% CO2的培養(yǎng)箱中。

1.3.2 MTT法檢測細胞活力

參考Hu[19]的方法，細胞計數(shù)后，用培養(yǎng)基將細胞稀釋為1×107cells/mL，移液槍吸取100 μL種入96孔板，每組設三個復孔，培養(yǎng)過夜后，加入AX，使其終濃度為0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL，放入培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除上清液，用無血清的培養(yǎng)基將MTT母液（5 mg/mL）稀釋為0.5 mg/mL的工作液，每孔加入100 μL MTT工作液，并設空白對照組，培養(yǎng)4 h后加100 μL stopping buffer，繼續(xù)培養(yǎng)16～20 h，酶標儀搖晃30 s混勻后在570 nm測定吸光度。

1.3.3 NO釋放量的檢測

細胞計數(shù)后，用培養(yǎng)基將細胞稀釋為1×107cells/mL，移液槍吸取100 μL種入96孔板，每組設三個復孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入終濃度為0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL的AX，同時設置陽性對照組，加入1 μg/mL的LPS，24 h后測NO釋放量。配制濃度0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L的NaNO2制作標準曲線，取100 μL細胞上清液于96孔板中，加入100 μL Griess試劑，室溫下反應10 min后于570 nm處測吸光度值。

1.3.4 半定量PCR檢測免疫關聯(lián)基因mRNA的表達

根據(jù)MTT和NO的結(jié)果，考慮高濃度的AX對細胞增殖有抑制作用，故選擇6.25 μg/mL的AX進行后續(xù)研究。調(diào)整細胞密度為5×106cells/mL，種入培養(yǎng)皿中，用6.25 μg/mL的AX分別處理細胞1、3、6 h，棄去培養(yǎng)基，加入1 mL Trizol于冰上裂解細胞，然后加入100 μL三氯甲烷，振蕩、離心后取水層加入等體積異丙醇，混勻后靜置，管底出現(xiàn)的膠狀沉淀即為RNA，用0.1% DEPC（焦炭酸二乙酯）水配制的75%乙醇清洗RNA，置于通風櫥中晾干，加入30 μL DEPC水溶解RNA，保存在-80 ℃冰箱中。

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列及PCR條件如表1所示。

表1 引物序列及PCR條件Table 1 Primer sequence and conditions for PCR

PCR反應體系如表2所示，配制1%瓊脂糖凝膠，每孔加10 μL PCR產(chǎn)物，電泳的條件為90 V，20 min，完成后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

表2 PCR反應體系Table 2 PCR reaction system

1.3.5 Western Blot檢測MAPK和Akt通路相關蛋白表達量

參考Zhang[20]的方法，調(diào)整細胞密度為5×106個/mL，種入培養(yǎng)皿中，6.25 μg/mL的AX處理細胞1、3、6 h，棄去培養(yǎng)基，加1 mL預冷的PBS，細胞刮收集細胞于1.5 mL離心管，離心去除上清液，沉淀中加入的RIPA細胞裂解液250 μL（含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑各2.5 μL），細胞超聲破碎儀冰浴破碎細胞，離心（4 ℃、12000 r/min）10 min收集上清，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，BSA作為標準品，蛋白上樣量為30 μg，上樣體系為25 μL。10% SDS-PAGE凝膠電泳（120 V，90 min）分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜上（100 V，70 min），5% BSA封閉2 h，TTBS清洗三次，一抗孵育過夜，TTBS清洗三次，二抗孵育2 h，清洗三次后加曝光液曝光。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 23.0軟件分析數(shù)據(jù)，Duncan法進行多組樣本間差異顯著性分析，p<0.05時表示差異顯著，使用Origin 2018繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 AX對小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響

為了驗證AX對小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響，用不同濃度的AX處理細胞24 h，實驗結(jié)果如圖1所示，AX濃度為6.25 μg/mL和12.5 μg/mL時細胞的存活率分別為90.42%和89.99%（p>0.05），對巨噬細胞的活力沒有顯著影響，隨著AX濃度逐漸增大，細胞的存活率顯著降低（p<0.05）。文獻報道AX對巨噬細胞沒有顯著毒性，本實驗中高濃度AX引起了細胞毒性，可能與AX中共價結(jié)合的酚酸（主要是阿魏酸）含量較高有關。阿魏酸對細胞沒有毒性作用，但會抑制細胞增殖[21,22]。

圖1 AX對小鼠腹腔巨噬細胞活力的影響Fig.1 Effect of AX on the activity of mouse peritoneal macrophages

2.2 AX對腹腔巨噬細胞NO釋放量的影響

一氧化氮（NO）是一種生物功能分子，參與了很多重要的生物學活動，NO的產(chǎn)生是活化巨噬細胞的殺傷機制。研究證實，從藥用植物或食物中分離的多糖可增加巨噬細胞中NO的產(chǎn)生，從而發(fā)揮免疫增強作用[23,24]。在本文研究中，如圖2所示，用不同濃度的AX（6.25～200 μg/mL）處理小鼠腹腔巨噬細胞24 h后，所有濃度的AX均能顯著增加NO的釋放（p<0.05），且與陽性對照LPS誘導的細胞產(chǎn)生的NO的含量（50.20 μmol/L）沒有顯著差異（p>0.05）；當AX濃度為6.25 μg/mL時，NO的釋放量為50.25 μmol/L，是空白對照組的16.78倍（p<0.05）。低濃度的NO（10～250 μmol/L）可以刺激細胞分裂，而高濃度的NO（>500 μmol/L），則會抑制細胞分裂[25]，說明AX誘導小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生的NO均對細胞增殖有促進作用。

圖2 AX對小鼠腹腔巨噬細胞NO釋放量的影響Fig.2 Effect of AX on the release of NO from mouse peritoneal macrophages

NO通過抑制DNA合成，引起氧化損傷，抑制細胞增殖和抗微生物防御作用[26]，在先天免疫系統(tǒng)中起著重要作用。類似的報告顯示，米糠阿拉伯木聚糖在RAW264.7細胞和小鼠腹腔巨噬細胞中均可以誘導NO釋放[27]；玉米麩皮酶改性堿提阿拉伯木聚糖（E-AEAX）和堿提阿拉伯木聚糖（AEAX）也均可以促進人U937單核細胞NO釋放量的增加[28]。說明AX可能通過NO途徑誘導免疫系統(tǒng)應答，從而增強天然免疫，維持機體健康。活化的巨噬細胞可以通過NO殺死腫瘤細胞，iNOS的表達起著關鍵作用，Zhang等[29]從小麥面粉中用水提取的AX和酶提AX均能通過增加的iNOS水平而不同程度地刺激NO的分泌。因此，推測AX通過激活小鼠腹腔巨噬細胞增加iNOS的表達來增加NO的釋放。

2.3 AX對腹腔巨噬細胞免疫關聯(lián)基因表達的影響

植物多糖可以激活巨噬細胞，活化的巨噬細胞通過分泌炎癥因子來調(diào)節(jié)免疫[15]，如TNF-α、IL-6、IL-1β。Nfkbia是核因子-κB（NF-κB）的抑制因子，可以阻止NF-κB信號通路的激活。細胞因子的分泌是一種細胞反應，其特征是受體和多種信號通路的協(xié)調(diào)激活。有研究表明，活化的MAPK和Akt信號通路可以通過刺激/抑制炎癥因子的產(chǎn)生和基因的表達來調(diào)節(jié)免疫[26,30,31]。為了探討AX對小鼠腹腔巨噬細胞免疫關聯(lián)基因mRNA表達的影響，用6.25 μg/mL的AX處理小鼠腹腔巨噬細胞0、1、3、6 h，半定量PCR檢測細胞中1L-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、Nfkbia等基因mRNA的表達。

如圖3所示，在正常細胞中，1L-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、Nfkbia等基因的mRNA幾乎不表達，而在AX處理之后的表達量顯著增加。在其他相關研究中，Diao等[32]發(fā)現(xiàn)白芨多糖誘導并提高RAW264.7細胞iNOS、TNF-α和IL-1β的mRNA水平，并增強這些基因的表達。Park[23]發(fā)現(xiàn)落葵多糖可以通過上調(diào)iNOS mRNA誘導RAW264.7細胞產(chǎn)生NO。目前的研究表明AX顯著增加了小鼠腹腔巨噬細胞中1L-1β、IL-6、TNF-α、iNOS、COX-2、Nfkbia基因的表達，這些數(shù)據(jù)說明AX在體外具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用。Srinivasan等[22]從兩個不同品種的小米中提取了兩種不同的酚酸結(jié)合AX（PCA-AXs）：PCA-AX-L和PCA-AX-K，發(fā)現(xiàn)高分支度的PCA-AX-L可以上調(diào)RAW264.7細胞TNF-α、iNOS和COX-2等基因mRNA的表達，而酚酸含量高的PCA-AX-K呈下調(diào)趨勢，推測AX發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用可能與它的結(jié)構相關，因此，未來還需要對AX進行詳細的結(jié)構分析和多靶點的分子機制研究，以確定其免疫調(diào)節(jié)潛能。

圖3 AX對小鼠腹腔巨噬細胞免疫關聯(lián)基因mRNA表達的影響Fig.3 Effect of AX on mRNA expression of immunoassociated genes in mouse peritoneal macrophages

2.4 AX對小鼠腹腔巨噬細胞MAPK和Akt信號通路的影響

多糖免疫刺激作用的一個重要機制是增強巨噬細胞的功能，細胞因子的分泌也是受多種信號通路和受體的協(xié)調(diào)激活。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogenactivated protein kinases，MAPK）是先天和適應性免疫反應的重要調(diào)節(jié)因子，細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）是MAPK通路的三個亞家族。ERK、JNK和p38在許多關鍵的細胞過程中發(fā)揮重要作用，調(diào)控基因（如TNF-α、IL-6、iNOS）表達[28,33]。蛋白激酶B（Akt）是生存激酶之一，參與調(diào)節(jié)細胞的生長、代謝和凋亡。有研究表明，Akt可能參與MAPK信號通路的激活[34]。為了檢測MAPK和Akt信號通路是否介導了AX處理的小鼠腹腔巨噬細胞的免疫關聯(lián)基因的表達，用6.25 μg/mL的AX處理細胞0、1、3、6 h，western blot檢測ERK1/2、JNK、p38 MAPK、Akt蛋白磷酸化水平的變化。

如圖4所示，AX處理后的小鼠腹腔巨噬細胞中ERK1/2、JNK、p38 MAPK、Akt蛋白的磷酸化水平較對照組顯著增加，AX處理1 h后，JNK、p38 MAPK的磷酸化水平達到了峰值；AX處理3 h后，Akt的磷酸化水平顯著增加；AX處理6 h后，ERK1/2的磷酸化水平顯著增加，這些結(jié)果表明AX的免疫反應主要是通過激活MAPK和Akt信號通路，這些結(jié)論在其他研究中也得到了證明。Ren[35]等發(fā)現(xiàn)白沙蒿多糖可以激活MAPK和PI3K/Akt通路，并且提高RAW264.7巨噬細胞ERK1/2、JNK、p38 MAPK、Akt蛋白的磷酸化水平；靈芝多糖[34]、黃芪多糖[36]也被證實能通過MAPK信號通路蛋白磷酸化誘導免疫細胞激活，說明AX可能通過刺激小鼠腹腔巨噬細胞激活MAPK和Akt通路，上調(diào)ERK1/2、JNK、p38 MAPK、Akt蛋白的磷酸化水平，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

圖4 AX對小鼠腹腔巨噬細胞MAPK和Akt信號通路的影響Fig.4 Effects of AX on MAPK and Akt signaling pathways in mouse peritoneal macrophages

3 結(jié)論

本文以小麥麩皮AX為對象，研究AX對小鼠腹腔巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)功能的影響。研究結(jié)果表明，AX可以刺激小鼠腹腔巨噬細胞產(chǎn)生NO，促進COX-2、iNOS、Nfkbia、1L-1β、IL-6、TNF-α基因mRNA的表達，其免疫反應可能是通過激活MAPK和Akt信號通路來實現(xiàn)的。因此，小麥麩皮AX可用于增強免疫功能和預防疾病，同時也為小麥麩皮的綜合利用提供新思路，需要更多的研究來闡明AX的結(jié)構在免疫應答中的作用。