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        葉綠素a測(cè)定方法的改進(jìn)

        2021-11-05 10:48:34李偉明
        現(xiàn)代鹽化工 2021年5期
        關(guān)鍵詞:國標(biāo)濾膜丙酮

        李偉明

        (福建省泉州環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站,福建 泉州 362000)

        葉綠素a是反映水體初級(jí)生產(chǎn)力的首要指標(biāo),也是評(píng)價(jià)水體富營養(yǎng)化水平的重要參數(shù)[1]。環(huán)境保護(hù)部[2]發(fā)布的《水質(zhì) 葉綠素a的測(cè)定 分光光度法》(HJ 897—2017,下稱國標(biāo)法)在地表水環(huán)境監(jiān)測(cè)中應(yīng)用最廣泛,以90.0%丙酮為溶劑研磨提取葉綠素a。該方法過程煩瑣、耗時(shí)較長,容易因?yàn)槎啻无D(zhuǎn)移樣品產(chǎn)生操作誤差和受光降解反應(yīng)影響導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果失真。為了優(yōu)化葉綠素a的提取過程、提高監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性,本研究探討了葉綠素a的提取方法。

        提取葉綠素a的關(guān)鍵在于對(duì)細(xì)胞壁進(jìn)行有效的破壞?,F(xiàn)代動(dòng)植物細(xì)胞破壁技術(shù)主要有超聲波法、珠磨法、化學(xué)滲透法[3-4]。超聲波法和珠磨法被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)樣品的研磨與提取,本研究在此基礎(chǔ)上改進(jìn)方法。在實(shí)驗(yàn)室中,分別用研磨法和超聲波法對(duì)泉州市某水庫水樣的葉綠素a進(jìn)行多次測(cè)定及比較,證實(shí)將超聲波法和珠磨法應(yīng)用于葉綠素a的測(cè)定是可行的,實(shí)驗(yàn)取得了令人滿意的結(jié)果。

        1 實(shí)驗(yàn)

        1.1 儀器與試劑

        (1)儀器:分光光度計(jì)(Ⅴ-1800,上海美譜達(dá)儀器有限公司),離心機(jī)(TDZ5-WS,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司),超聲儀(杭州飛華環(huán)保器材廠),抽濾裝置。

        (2)試劑:90.0%丙酮,1.0%碳酸鎂懸濁液。

        1.2 樣品采集及處理

        使用有機(jī)玻璃采水器采集泉州市某水庫某斷面表層、中層及底層水樣,采樣體積為1.0 L,轉(zhuǎn)移至1.0 L配有磨口塞的棕色玻璃瓶中,每升樣品加1 mL碳酸鎂懸濁液,以防止酸化引起色素波長偏移,同時(shí)套上黑色布袋避光保存。

        1.3 國標(biāo)法制備試樣

        準(zhǔn)確量取500 mL混勻水樣,用0.45 μm玻璃纖維濾膜進(jìn)行抽濾,再用少量蒸餾水清洗濾器壁,在樣品剛剛完全通過濾膜時(shí)結(jié)束抽濾,用鑷子取下濾膜,將有樣品的一面對(duì)折,用濾紙吸干濾膜水分。將樣品濾膜置于研缽中,加入3~4 mL 90.0%丙酮,研磨至糊狀,補(bǔ)加3~4 mL 90.0%丙酮繼續(xù)研磨。保證充分研磨5 min以上,將完全破碎的細(xì)胞提取液轉(zhuǎn)移至10 mL具塞刻度離心管中,用丙酮沖洗研缽和研磨杵,一并轉(zhuǎn)移至離心管中,定容至10 mL?;靹蚝笥? ℃下避光浸泡提取2.0 h,在浸泡過程中顛倒混勻3次。用離心機(jī)以4 000 r/min離心10 min,用針式過濾器過濾上清液得到丙酮提取液(試樣),待測(cè)。

        1.4 珠磨法制備試樣

        準(zhǔn)確量取500 mL混勻水樣,用0.45 μm玻璃纖維濾膜進(jìn)行抽濾,再用少量蒸餾水清洗濾器壁,在樣品剛剛完全通過濾膜時(shí)結(jié)束抽濾,用鑷子取下濾膜,將有樣品的一面對(duì)折,用濾紙吸干濾膜水分。將樣品對(duì)折后置于15 mL具塞刻度離心管中,用90.0%丙酮溶液定容至10 mL標(biāo)線后加入3顆不銹鋼珠。將離心管置于研磨儀中,在50 Hz的頻率下振動(dòng)研磨 5 min后,于4 ℃下避光浸泡提取2.0 h,在浸泡過程中顛倒混勻3次。用離心機(jī)以4 000 r/min離心10 min,用針式過濾器過濾上清液得到丙酮提取液(試樣),待測(cè)。

        1.5 超聲波法制備試樣

        準(zhǔn)確量取500 mL混勻水樣,用0.45 μm玻璃纖維濾膜進(jìn)行抽濾,再用少量蒸餾水清洗濾器壁,在樣品剛剛完全通過濾膜時(shí)結(jié)束抽濾,用鑷子取下濾膜,將有樣品的一面對(duì)折,用濾紙吸干濾膜水分。將樣品對(duì)折后置于15 mL具塞刻度離心管中,用90.0%丙酮溶液定容至10 mL標(biāo)線。將離心管置于50 ℃水浴中,在100 Hz的頻率下超聲破碎20 min后,于4 ℃下避光浸泡提取2.0 h,在浸泡過程中顛倒混勻3次。用離心機(jī)以4 000 r/min離心10 min,用針式過濾器過濾上清液得到丙酮提取液(試樣),待測(cè)。

        1.6 樣品的測(cè)定

        將用不同方法制備的試樣移至1 cm比色皿中,以90.0%丙酮溶液為參比溶液,于波長750、664、647、630 nm處測(cè)量吸光度[2]。用下式計(jì)算葉綠素a的質(zhì)量濃度。

        式中:ρ為試樣中葉綠素a的質(zhì)量濃度,mg/L;A750為試樣在750 nm波長下的吸光度;A664為試樣在664 nm波長下的吸光度;A647為試樣在647 nm波長下的吸光度;A630為試樣在 630 nm波長下的吸光度;V為提取液定容后的體積,mL;0.5為本次水庫水樣的體積,L。

        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

        2.1 比對(duì)實(shí)驗(yàn)

        采集泉州市某水庫同一斷面表層、中層及底層水樣,分別用國標(biāo)法、珠磨法及超聲波法制備7個(gè)試樣進(jìn)行測(cè)定分析。通過對(duì)3種方法測(cè)定結(jié)果(見表1)的比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),測(cè)定結(jié)果有明顯差異,超聲波法與珠磨法的測(cè)定值明顯高于國標(biāo)法,從相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差可以看出,超聲波法與珠磨法的平行性差異不明顯,離散情況優(yōu)于國標(biāo)法。

        表1 實(shí)際水樣精密度測(cè)定結(jié)果

        2.2 原因分析

        通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),超聲波法與珠磨法的測(cè)定值相近且高于國標(biāo)法,平行性優(yōu)于國標(biāo)法。根據(jù)同系統(tǒng)專家意見,在實(shí)驗(yàn)過程中,由于國標(biāo)法需要進(jìn)行2~3次人工研磨,在提取葉綠素a的過程中,每個(gè)樣品要光照約20 min,葉綠素a容易發(fā)生光敏降解反應(yīng)。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),葉綠素a在高溫和光照條件下能降解。在15 ℃、正午日照條件下,葉綠素a的降解半衰期為6~7 min,在日光燈照射下為5.5 h,在黑暗處為23 d[5]。此外,按照國標(biāo)法操作,樣品提取液在多次轉(zhuǎn)移過程中容易損失,影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和精密度。因此,超聲波法及珠磨法的提取過程基本在密閉容器中的黑暗處進(jìn)行,環(huán)境溫度控制在室溫20 ℃左右,可以有效減少高溫及光照對(duì)葉綠素a降解的影響,同時(shí)不需要對(duì)樣品提取液進(jìn)行再次轉(zhuǎn)移,避免了轉(zhuǎn)移造成的樣品損失,能保證較高的提取效率。

        3 結(jié)論

        (1)丙酮是低毒物質(zhì),主要對(duì)中樞神經(jīng)起麻醉作用,濃度較高時(shí)會(huì)引起耳鼻等部位的炎癥,特別嚴(yán)重的情況下甚至?xí)斐苫杳?。相比于國?biāo)法,超聲波法和珠磨法減少了操作人員和丙酮的接觸,保護(hù)了操作人員的身體健康,而且實(shí)驗(yàn)步驟簡單、耗時(shí)短,減少了樣品轉(zhuǎn)移、研磨不完全和光敏降解反應(yīng)造成的樣品損失,提高了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和精確性。

        (2)通過不同方法的實(shí)驗(yàn)室比對(duì)發(fā)現(xiàn),超聲波法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在1.8%~3.3%,珠磨法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在1.5%~4.0%,國標(biāo)法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍在4.9%~5.4%,可見超聲波法及珠磨法的精密度優(yōu)于國標(biāo)法,滿足環(huán)境監(jiān)測(cè)分析要求,適合在環(huán)境監(jiān)測(cè)工作中推廣應(yīng)用。

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