周連玉， 焦璐， 羅巧玉， 蔣霞

(青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海省青藏高原生物多樣性形成機(jī)制與綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，青海 西寧 810016)

許多研究關(guān)注禾草類植物與內(nèi)生真菌互作的關(guān)系，禾草類植物內(nèi)生真菌屬于香燭菌屬Epichloespp.或其無性系Neotyphodium屬[1]，體外培養(yǎng)時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢[2]。內(nèi)生真菌在植物體內(nèi)系活體營養(yǎng)，仿佛是構(gòu)成植物的一個(gè)組織，在體內(nèi)生長(zhǎng)并發(fā)揮多重作用[3]。近30 a來，尤其在黑麥草屬和羊茅屬等禾草類的研究表明，內(nèi)生真菌促進(jìn)其地上部分、根系的生長(zhǎng)[4-5]，提高宿主適應(yīng)非生物和生物脅迫的能力[6]。

化感作用是指植物或微生物通過向環(huán)境中釋放某些化學(xué)物質(zhì)從而對(duì)其他植物或微生物產(chǎn)生作用。一些研究[7-10]報(bào)道了內(nèi)生真菌活體營養(yǎng)或者腐生營養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)，表現(xiàn)出不同程度的化感作用。中華羊茅(Festucasinensis)是一種內(nèi)生真菌侵染率高的多年生草本植物，具有適口性好、營養(yǎng)價(jià)值高、抗寒、抗旱、發(fā)病率低等優(yōu)勢(shì)[11-13]。本研究以中華羊茅Epichloesp.菌株為材料，探討在培養(yǎng)過程中菌絲體生物量的變化規(guī)律以及發(fā)酵液的化感作用，旨在為中華羊茅內(nèi)生真菌進(jìn)一步的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

中華羊茅內(nèi)生真菌Epichloesp.菌株保存于青海師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

中華羊茅種子由蘭州大學(xué)草地保護(hù)所提供。

PDA培養(yǎng)基用于菌株分離純化，配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。PDB培養(yǎng)基作為液體菌種制備的培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蒸餾水1 000 mL。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為山梨醇100.0 g、酵母膏3.0 g、葡萄糖40.0 g、色氨酸0.8 g、谷氨酸10.0 g、KH2PO40.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蒸餾水1 000 mL、pH 5.6[14]。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的培養(yǎng)

將3塊直徑為4 mm的菌塊接種于PDB培養(yǎng)基中，150 mL三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)液，于25 ℃、130 r·min-1搖床培養(yǎng)15 d，所獲培養(yǎng)液作為液體菌種。將液體菌種3 mL接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，150 mL三角瓶中裝入100 mL培養(yǎng)液，25 ℃、130 r·min-1培養(yǎng)，在培養(yǎng)10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60 d時(shí)分別測(cè)定菌絲體生物量。

1.2.2 菌絲體生物量的測(cè)定

發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)兩層紗布過濾收集發(fā)酵液和菌絲體，發(fā)酵液用于生物活性測(cè)定，菌絲體經(jīng)蒸餾水沖洗數(shù)次后，于60 ℃干燥至恒重，電子天平稱重測(cè)得菌絲體生物量。

1.2.3Epichloesp.發(fā)酵液對(duì)中華羊茅幼苗生長(zhǎng)的影響

挑選籽粒飽滿的中華羊茅種子，首先用75%的乙醇表面滅菌1 min，然后用無菌水沖洗3次，將種子分別在不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液原液(X)、10倍稀釋液(10X)、20倍稀釋液(20X)中浸泡24 h，以無菌水處理為對(duì)照，將種子放到鋪有兩層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿50粒，每日補(bǔ)充無菌水，以潤(rùn)濕濾紙為準(zhǔn)，設(shè)3個(gè)重復(fù)，14 d后測(cè)定各處理樣品根長(zhǎng)和苗長(zhǎng)。

依據(jù)Williamson等[15]介紹的方法來衡量發(fā)酵液的化感作用強(qiáng)度，計(jì)算公式RI=1-C/T，RI表示敏感指數(shù)，C表示對(duì)照值，T表示處理值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，菌絲體生物量指標(biāo)釆用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(LSD，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 深層液態(tài)發(fā)酵過程中菌絲體生長(zhǎng)規(guī)律

深層液態(tài)培養(yǎng)過程中Epichloesp.菌絲體生長(zhǎng)變化曲線見圖1。菌絲體干重與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)系呈現(xiàn)雙對(duì)數(shù)曲線關(guān)系，回歸方程式為lgY=-0.816 8lgX2+2.622 4lgX-0.455 3，其中Y為菌絲體干重，X為培養(yǎng)時(shí)間，R2=0.963 3。培養(yǎng)40～45 d菌絲體生長(zhǎng)量達(dá)到最高值，顯著高于其他培養(yǎng)時(shí)間(P<0.05)，培養(yǎng)45 d后菌體出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。

不同培養(yǎng)時(shí)間的數(shù)據(jù)之間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 Epichloe sp.對(duì)中華羊茅幼苗生長(zhǎng)的影響

從表1可見，各處理與對(duì)照相比，除處理25 d和40 d的發(fā)酵液20倍稀釋液對(duì)苗長(zhǎng)有抑制作用外，其他各處理均促進(jìn)苗的伸長(zhǎng)，其中促進(jìn)效果較好的處理依次為：培養(yǎng)20 d的發(fā)酵液稀釋20倍>培養(yǎng)60 d的發(fā)酵液稀釋10倍>培養(yǎng)50 d的發(fā)酵液稀釋10倍。發(fā)酵液對(duì)根長(zhǎng)的影響與苗長(zhǎng)不一樣，27.27%的處理抑制根的伸長(zhǎng)，69.70%的處理促進(jìn)根的伸長(zhǎng)。促進(jìn)根伸長(zhǎng)效果好的處理為培養(yǎng)20 d和30 d的發(fā)酵原液，抑制作用最強(qiáng)的處理為培養(yǎng)45 d的發(fā)酵液稀釋20倍，抑制效率為68.00%。對(duì)苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)均有促進(jìn)作用的處理占總處理的66.67%；只有培養(yǎng)40 d的發(fā)酵液稀釋20倍時(shí)，對(duì)幼苗和根的伸長(zhǎng)均具有抑制作用，抑制效率分別為28.76%和19.15%。

表1 Epichloe sp.發(fā)酵液對(duì)中華羊茅幼苗生長(zhǎng)的影響

3 小結(jié)與討論

多數(shù)從固體培養(yǎng)方式對(duì)黑麥草、高羊茅、醉馬草、中華羊茅禾草內(nèi)生真菌菌株生理特性進(jìn)行相關(guān)研究[16-18]。本試驗(yàn)中華羊茅內(nèi)生真菌在液體培養(yǎng)基質(zhì)中生長(zhǎng)比較緩慢，于培養(yǎng)40～45 d菌絲體生長(zhǎng)量達(dá)到最高值，菌絲體生物量與培養(yǎng)時(shí)間之間呈雙對(duì)數(shù)曲線關(guān)系，與以往研究[19]的結(jié)果相似。

化感作用與真菌發(fā)酵液的濃度密切相關(guān)。孫鋒[20]以不同濃度木霉發(fā)酵液處理抗蟲棉種子，發(fā)現(xiàn)50倍稀釋液顯著增加幼苗根系長(zhǎng)度和質(zhì)量。不同濃度蜜環(huán)菌發(fā)酵液對(duì)油菜種子萌發(fā)后苗和根的作用表現(xiàn)是不同的，當(dāng)發(fā)酵液濃度為10%時(shí)促進(jìn)苗伸長(zhǎng)的作用最明顯；對(duì)幼苗根的抑制作用，呈現(xiàn)出隨發(fā)酵液濃度增加而抑制效果增強(qiáng)的趨勢(shì)[21]。彩色馬勃菌絲體的乙醇提取液對(duì)油菜種子的發(fā)芽及幼苗的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，相同培養(yǎng)時(shí)間不同稀釋倍數(shù)發(fā)酵液，其化感效果也不一致，隨著培養(yǎng)20 d的發(fā)酵液稀釋倍數(shù)增加，對(duì)苗長(zhǎng)促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)；而培養(yǎng)時(shí)間50 d和60 d的發(fā)酵液，隨稀釋倍數(shù)增加對(duì)苗長(zhǎng)促進(jìn)作用表現(xiàn)為先升后降；培養(yǎng)時(shí)間35 d的發(fā)酵液對(duì)根長(zhǎng)的抑制作用表現(xiàn)為隨著稀釋倍數(shù)增加化感效果不斷增加；這些研究結(jié)果與上述報(bào)道的結(jié)果相似。

一些研究[4,23-25]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生較多的吲哚乙酸或赤霉素，以此來增加植株的根重和總生物量。Prestidge等[26]指出，多年生黑麥草的水浸提液明顯抑制白三葉苗根的生長(zhǎng)，此外，也對(duì)白三葉的干重具有顯著抑制效果[8]。Springer[27]研究表明，與E-高羊茅相比，E+高羊茅對(duì)三葉草生長(zhǎng)的抑制作用更強(qiáng)，說明內(nèi)生真菌能增強(qiáng)植物的化感效應(yīng)。楊松等[7]試驗(yàn)表明，內(nèi)生真菌對(duì)不同植物發(fā)揮的化感效果不一致，E+披堿草顯著促進(jìn)了多年生黑麥草的苗長(zhǎng)，而對(duì)苗重有顯著抑制作用；E+披堿草草粉顯著抑制了高羊茅的根長(zhǎng)、苗長(zhǎng)和苗重，而顯著促進(jìn)了其根重。王偉等[10]研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)核桃內(nèi)生真菌菌株產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)小麥幼芽和幼根有不同程度的抑制作用。

曾任森等[28]對(duì)日本曲霉發(fā)酵液化感作用的研究發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)條件、pH影響發(fā)酵液對(duì)幼苗生長(zhǎng)的抑制效果。趙昕梅等[9]從野生鐵皮石斛分離到4株內(nèi)生真菌菌株，鐮刀菌屬菌株TPSH3發(fā)酵液對(duì)宿主生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，菌株TPSH4發(fā)酵液表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)作用，且不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液對(duì)宿主促生作用有一定的差別。本試驗(yàn)中不同發(fā)酵時(shí)間的發(fā)酵液對(duì)幼苗苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)的化感作用不相同，發(fā)酵時(shí)間為20 d的20倍稀釋液或原液分別對(duì)苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)具有更強(qiáng)的促進(jìn)作用；在抑制作用方面，對(duì)苗長(zhǎng)和根長(zhǎng)的抑制效果最大的分別為培養(yǎng)40 d和45 d的20倍稀釋液，這與前人研究的結(jié)果一致，說明中華羊茅Epichloesp.代謝產(chǎn)物中存在化感物質(zhì)，至于化感物質(zhì)的具體化學(xué)成分有待研究。