洪霞， 陳孝賞， 王嬌陽(yáng)， 屈為棟， 邱莉萍， 陳銀龍

(臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 臺(tái)州 317000)

芋多年生，屬天南星科芋屬植物，在世界上廣為栽培，中國(guó)是重要的起源地之一，以珠江流域、臺(tái)灣地區(qū)種植最多，其次是長(zhǎng)江及淮河流域[1]。芋的地下部球莖、葉片、葉柄、花等部位可作蔬菜，芋具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，淀粉、可溶性糖、蛋白質(zhì)含量較高，含有多種維生素與礦物質(zhì)[2]，此外，芋多糖在降血糖、抗腫瘤、提高機(jī)體免疫力等方面有較高的藥用價(jià)值[3-4]。浙江省歷來(lái)有種植芋用以食用與藥用的傳統(tǒng)，各地芋小種眾多，且具有較好的經(jīng)濟(jì)效益[5-6]。

在基因與環(huán)境的共同作用下，物種形成了豐富的遺傳多樣性，成為寶貴的育種種質(zhì)資源。這種遺傳多樣性還受到生活史特性、繁育方式、人工選擇馴化、地理分布等多種因素的影響[7]。種質(zhì)資源的保護(hù)工作日益受到重視，與實(shí)現(xiàn)種業(yè)現(xiàn)代化息息相關(guān)。全國(guó)種質(zhì)資源普查行動(dòng)已作為重點(diǎn)工作之一，而種質(zhì)的遺傳多樣性研究已成為研究熱點(diǎn)。隨著基因工程的發(fā)展與測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，rbcL、matK、trnH-psbA等DNA序列分析為種質(zhì)的分類、鑒定提供了有效的方法，在茶樹(shù)、辣椒、水稻等作物獲得較好應(yīng)用[8-10]。有研究利用rbcL+trnH-psbA結(jié)合序列以及ITS序列對(duì)芋屬內(nèi)各種之間進(jìn)行區(qū)分與鑒定[11-12]，其中，trnH-psbA序列是葉綠體基因間隔非編碼區(qū)，進(jìn)化速率快，變異位點(diǎn)信息豐富。浙江省芋種質(zhì)資源豐富，特別是地方小種多，本研究在前期性狀調(diào)查的基礎(chǔ)上，對(duì)不同地源的芋地方種進(jìn)行trnH-psbA序列結(jié)構(gòu)與進(jìn)化分析，為芋種質(zhì)的DNA條形碼應(yīng)用、遺傳多樣性分析以及進(jìn)一步保護(hù)利用等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的30份芋材料在浙江省各縣市收集而來(lái)，屬當(dāng)?shù)胤N植小種。2019—2020年種植于浙江省芋種質(zhì)資源圃，2020年7月選取幼嫩葉片，低溫保存。具體材料信息見(jiàn)表1。

表1 供試的30份浙江芋種質(zhì)資源

1.2 DNA提取與PCR擴(kuò)增

取低溫保存的芋葉片，加入液氮并用研缽磨成細(xì)粉，使用CTAB法提取全基因組DNA，1%瓊脂糖凝膠鑒定DNA純度，在測(cè)定核酸濃度后用滅過(guò)菌的去離子水稀釋約至50 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆?。trnH-psbA片段擴(kuò)增正向引物5′-GTTAT GCATGAACGTAATGCTC-3′，反向引物5′-CGCGCA TGGTG-GATTCACAATCC-3′，使用KODFX高保真酶擴(kuò)增，總反應(yīng)體系50 μL，其中2×KODFX buffer 25 μL、2 mmoL·L-1dNTPs 10 μL、0.5 μmoL·L-1的正反引物各1.5 μL、DNA模板2.5 μL、KODFX聚合酶1 μL。序列擴(kuò)增在BIORED PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性20 s，57.5 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min；35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)擴(kuò)增條帶，條帶清晰單一的樣品由金唯智(江蘇)生物技術(shù)公司測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)獲得的結(jié)果使用Condon code aligner v.8.0.2進(jìn)行拼接，去除低質(zhì)量序列，保留引物序列。使用MEGA X[13]進(jìn)行序列比對(duì)，統(tǒng)計(jì)序列的特征，如序列的GC含量、變異位點(diǎn)、保守位點(diǎn)和信息位點(diǎn)，計(jì)算不同地方小種的遺傳距離，使用最大似然法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。群體的單倍型數(shù)、單倍型多樣性、單倍型多樣性標(biāo)準(zhǔn)差、單倍型多樣性方差、中性檢驗(yàn)分析數(shù)值(Tajima′D，F(xiàn)u and Lis F值)由DnaSP v.5.10[14]軟件統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地源種質(zhì)葉綠體基因trnH-psbA序列差異分析

通過(guò)對(duì)30份不同地源的芋種質(zhì)trnH-psbA序列克隆分析，結(jié)果表明，trnH-psbA序列長(zhǎng)度為730～739 bp，GC含量為22.4%～22.9%，存在3種不同的類型，其中屬于類型Ⅰ序列的資源最多，有21份，類型Ⅱ最少只有4份，類型Ⅲ有5份。30份資源的保守位點(diǎn)為717個(gè)，變異位點(diǎn)為13個(gè)，全部為自裔位點(diǎn)；插入/缺失位點(diǎn)位于339 bp、533～598 bp、617～624 bp；二倍簡(jiǎn)并位點(diǎn)187個(gè)，四倍簡(jiǎn)并位點(diǎn)為53個(gè)(表2)。

表2 不同芋種質(zhì)trnH-psbA序列變異位點(diǎn)

2.2 單倍型多樣性與中性檢驗(yàn)分析

單倍型多樣性分析表明30份芋資源trnH-psbA序列分離位點(diǎn)為13個(gè)，單倍型數(shù)為2個(gè)，單倍型多樣性為0.457 06，核苷酸多樣性為0.005 15，單倍型多樣性方差為0.008 41，標(biāo)準(zhǔn)差為0.092。利用Tajima′D檢驗(yàn)得D值為0.888 91，P>0.1；Fu and Lis F檢驗(yàn)值為1.374 12，P>0.1。上述結(jié)果表明物種水平上芋資源trnH-psbA序列符合中性進(jìn)化假設(shè)模型。

2.3 芋種質(zhì)資源的遺傳距離與聚類分析

30份芋種質(zhì)資源的遺傳距離變化范圍較小，為0～0.018 1，平均遺傳距離為0.005 2，其中類型Ⅲ的芋資源全部來(lái)自溫州，與其他2種類型的遺傳距離最大，彼此之間的遺傳距離為0，而類型Ⅰ與類型Ⅱ之間的遺傳距離也為0。由最大似然法的聚類分析也可以看到，在100%的自展支持率下，30份芋種質(zhì)資源分為2個(gè)分支，第一個(gè)分支有25份資源，由類型Ⅰ與類型Ⅱ組成，在浙江省各縣市均有分布，第二個(gè)分支僅有5份資源，全部來(lái)自溫州(圖1)。

圖1 30份芋資源的聚類

3 小結(jié)與討論

植物的遺傳進(jìn)化與基因、環(huán)境、地理隔離等相關(guān)[15-16]。應(yīng)用DNA條形碼基因分析芋屬的分子進(jìn)化以及遺傳多樣性已有相關(guān)研究，表明利用序列差異能夠區(qū)分不同的芋族，但是利用不同芋小種深入分析同種芋的序列差異性與進(jìn)化的報(bào)道較少。本分析浙江省不同區(qū)域收集的芋資源，發(fā)現(xiàn)30份種質(zhì)資源序列長(zhǎng)度為730～739 bp，差異序列有3種，單倍型有2種，保守位點(diǎn)有717個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)13個(gè)，遺傳距離0～0.018 1，不同類型的遺傳距離較小，這可能跟芋的栽培引種相關(guān)；溫州區(qū)域的5份資源與其他資源遺傳距離較大，聚類自成一支，表明浙江省內(nèi)的芋存在一定的地理隔離，導(dǎo)致分化，trnH-psbA序列的差異可以明確溫州區(qū)域芋種質(zhì)的進(jìn)化地位。

30份資源的單倍型多樣性為0.457 06，Tajima′D檢驗(yàn)的D值、Fu and Lis F檢驗(yàn)值均大于零，但無(wú)顯著差異，表明物種水平上序列的進(jìn)化符合中性進(jìn)化假設(shè)，這可能跟芋自身的特點(diǎn)相關(guān)。芋雖然在浙江省內(nèi)各地區(qū)均有分布，但自然開(kāi)花少，異交率低，基本為地方小種；此外，據(jù)調(diào)查芋種植的農(nóng)家自留種較多[17-18]。

通過(guò)對(duì)芋資源的聚類分析發(fā)現(xiàn)，5份來(lái)自溫州的芋資源變異序列類型Ⅲ由2份紫紅柄魁芋與3份烏綠柄多子芋組成；根據(jù)序列的差異類型，類型Ⅱ與類型Ⅰ聚在一支，但類型Ⅱ的4份資源全為綠柄多子芋，這表明序列的差異與芋的表型具有一定關(guān)聯(lián)。綜上所述，基于序列的差異分析地方芋種的遺傳多樣性，表明雖然芋有長(zhǎng)期的引種馴化與栽培歷史，但不同的地方性小種仍存在一定的地理隔離，具有其自身生物學(xué)特點(diǎn)。這也證明了對(duì)地方芋種質(zhì)資源加強(qiáng)保護(hù)的必要性，它們是芋品種改良重要的種質(zhì)資源基礎(chǔ)。上述研究將為芋地方種的進(jìn)一步保護(hù)、利用、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等提供理論依據(jù)。