黃秀， 柯甫志， 孫立方， 王平， 聶振朋， 徐建國， 孫建華

(浙江省柑橘研究所 國家柑橘品種改良浙江分中心，浙江 臺州 318026)

柑橘是世界上栽培面積最大、產(chǎn)量最高的水果，也是我國第一大水果作物[1]。柑橘以其濃郁的風味和豐富的營養(yǎng)價值深受消費者的喜愛，隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展以及國民消費水平的提高，對柑橘的品質(zhì)及品種多樣性提出了更高的要求，柑橘品種的更新顯得尤為重要。溫州蜜柑是浙江省主栽的柑橘品種之一，改良溫州蜜柑現(xiàn)有品種，選育出更早熟、含糖量高的溫州蜜柑新品系一直是浙江柑橘育種的主要目標。通過珠心苗選育新品種是溫州蜜柑育種的重要途徑，但溫州蜜柑類因雄性不育一般表現(xiàn)無核，自然狀態(tài)很難形成種子[2]，給新品種選育工作增加了難度。為培育溫州蜜柑珠心苗，本實驗選用溫州蜜柑品系由良(CitrusunshiuYura)為母本，由良屬于早熟溫州蜜柑類，由宮川芽變選育而來[3-4]，是近幾年浙江省主要推廣的品種之一，具有高糖、化渣、易剝皮、成熟期早等特性。采用有性雜交的方法，利用不同品種的花粉對由良進行授粉，培育一批由良溫州蜜柑的珠心苗和雜交后代群體，并對不同授粉組合的果實坐果率、結(jié)籽率、種子發(fā)育等情況進行統(tǒng)計分析，研究不同品種花粉授粉對溫州蜜柑結(jié)籽的影響，進而篩選出一種獲取溫州蜜柑后代群體的有效方法，加快溫州蜜柑育種進程，培育出更多符合市場需求的新品種。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗在浙江省柑橘研究所試驗站種植園進行，以樹齡4 a的由良溫州蜜柑為母本，父本為雞尾葡萄柚(CitrusparadisiMacf)、四季柚(Citrusgrandis(Linn) Osbeck)、日本夏橙(2倍體)(CitrusnatsudaidaiHayata)和4倍體日本夏橙(CitrusnatsudaidaiHayata)。父本花粉取自浙江省柑橘研究所種質(zhì)資源圃，用4種花粉分別對由良母本進行授粉。授粉組合為：由良×雞尾葡萄柚；由良×四季柚；由良×日本夏橙；由良×4倍體日本夏橙；以花朵自然開放未處理的母本樹為對照組，簡稱為CK。

1.2 雜交授粉

于2020年4月8日采集4種父本花粉。選擇即將要開放的花苞帶回實驗室，用鑷子將雄蕊取出放在培養(yǎng)皿中，置于25～28 ℃的環(huán)境下烘干，然后貯存在2 mL離心管中備用。4月10日在母本盛花期進行授粉，選大小、花量、長勢相似的15棵由良母本樹，每棵樹授粉200～300朵花，每棵樹為一個生物學重復，每個雜交組合設(shè)置3個生物學重復。選擇花苞大但未開放的花朵，用棉簽蘸取準備好的花粉輕輕涂抹在柱頭上進行授粉，將雜交枝條上已經(jīng)開放和未授粉的花朵摘除，統(tǒng)計授粉花朵數(shù)。授粉當天噴施50 mg·kg-1赤霉素?；ǎ⑻缀貌ＡЪ埓?，1周后將玻璃紙袋去掉。在第1次生理落果之前再次噴施50 mg·kg-1赤霉素保果，之后田間管理同日常。

1.3 I2-KI溶液染色法檢測花粉活力

I2-KI溶液的配制：稱取2 g KI溶于10 mL超純水中，加入1 g I2，攪拌至完全溶解后定容至300 mL，存貯在棕色瓶中備用。

花粉活力測定：取1粒雜交授粉所用花粉的花藥置于載玻片上，加1滴超純水，用鑷子將花藥搗碎釋放出花粉粒，再加2滴I2-KI溶液，小心蓋上蓋玻片，在電子顯微鏡下觀察。同一視野下統(tǒng)計出藍色和黃褐色的花粉粒數(shù)，1張片子查看5個不同視野，每個品種查看4張玻片，凡是被I2-KI溶液染成藍色的為含有淀粉、活力較強的花粉粒，染成黃褐色的為發(fā)育不良的花粉粒。

1.4 雜交果實的處理

在2020年9月27日果實成熟時將雜交果實采摘帶回實驗室進行數(shù)據(jù)采集，統(tǒng)計每個雜交組合所獲得的雜交果數(shù)。每個生物學重復隨機選取30個果實，記錄每個果實的單果重、可食率、縱徑、橫徑、種子數(shù)，觀察種子發(fā)育情況。單果種子數(shù)=種子總數(shù)/果實總數(shù)，果形指數(shù)=縱徑/橫徑。種子發(fā)育情況分為3類：1) 飽滿：種子發(fā)育完全，胚乳飽滿；2) 干癟：種子發(fā)育一般，胚乳半飽滿；3) 退化：種皮存在，胚乳基本敗育或完全消失，具體情況如圖1所示。

圖1 種子發(fā)育的情況分類

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和整理，采用Sigmplot軟件進行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)分析方法選用新復極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種的花粉活力

由表1可知，不同品種花粉活力不同，4倍體日本夏橙花粉活力最強，為72.68%；其次是日本夏橙、四季柚和雞尾葡萄柚，分別為67.15%、61.47%和61.31%。分析得出，4倍體日本夏橙與日本夏橙相比花粉活力差異不顯著，與雞尾葡萄柚和四季柚差異達到顯著水平；日本夏橙、雞尾葡萄柚和四季柚的花粉活力差異未達到顯著性水平。雞尾葡萄柚和日本夏橙標準誤較大，分別為5.57和3.48，說明其花粉個體間活力差異較大。

表1 不同品種花粉的活力差異

2.2 不同花粉授粉對由良果實坐果率的影響

不同品種花粉對由良授粉，果實坐果率差異明顯(表2)。自然狀態(tài)下對照組由良果實坐果率為23.37%；其余4個處理組，由良×雞尾葡萄柚組合的坐果率較高，達到38.17%，與對照比較達到極顯著差異；其次是由良×日本夏橙和由良×四季柚，坐果率分別為36.78%和33.40%，均極顯著高于對照；由良×4倍體日本夏橙組合的坐果率最低，僅有24.52%，與對照差異不顯著?？傮w來說，雞尾葡萄柚、日本夏橙和四季柚花粉對由良授粉均能極顯著提高果實坐果率，雞尾葡萄柚授粉果實坐果率提升效果最好，4倍體日本夏橙授粉對由良果實坐果率影響不顯著。

表2 不同花粉授粉對果實坐果率的影響

2.3 不同花粉授粉對由良種子形成的影響

不同花粉授粉對由良果實結(jié)籽情況影響不同(表3)。在5個組合中，由良×雞尾葡萄柚組合獲得的種子數(shù)最多，達到149粒；其次是由良×日本夏橙組合，101粒；再次是由良×四季柚組合，64粒；由良×4倍體日本夏橙組合的果實結(jié)籽較少，為32粒；對照組未得到種子。單果種子數(shù)從高至低依次為：由良×雞尾葡萄柚組合、由良×日本夏橙組合、由良×四季柚組合、由良×4倍體日本夏橙組合、對照組。由良×雞尾葡萄柚組合的單果種子數(shù)與由良×四季柚組合、由良×4倍體日本夏橙組合以及對照組相比，差異達到極顯著水平；由良×日本夏橙和由良×四季柚組合單果種子數(shù)顯著高于對照；由良×4倍體日本夏橙組合與對照差異不顯著。所有組合種子胚性均為多胚。總的來說，由良在常規(guī)自然雜交條件下基本無種子形成，采用雞尾葡萄柚花粉對由良授粉所得種子數(shù)最多，單果種子數(shù)最高。

表3 不同花粉授粉對由良種子形成的影響

2.4 不同花粉授粉對種子發(fā)育情況的影響

從表4和圖2可知，不同雜交組合對種子發(fā)育情況影響不同。對照組沒有得到種子，在其余4組中，由良×四季柚組合所得種子的飽滿率最高，為63.49%；其次是由良×日本夏橙組合和由良×雞尾葡萄柚組合，分別為61.56%和51.74%；由良×4倍體日本夏橙組合的種子飽滿率最低，為6.67%。分析得出，由良×四季柚組合、由良×日本夏橙組合以及由良×雞尾葡萄柚組的種子飽滿率極顯著高于對照組和由良×4倍體日本夏橙組合；由良×四季柚組合、由良×日本夏橙組合以及由良×雞尾葡萄柚組合之間差異不顯著性；對照組與由良×4倍體日本夏橙組合相比差異未達到顯著水平。不同授粉組合對種子干癟率的影響不同，由良×4倍體日本夏橙組合和由良×四季柚組合種子干癟率最低，分別為2.78%和9.79%，兩者相比差異不顯著；由良×日本夏橙組合種子的干癟率為20.19%，由良×雞尾葡萄柚組合的種子干癟率最高，為36.65%；雞尾葡萄柚組合和夏橙組合種子干癟率較高，可能與花粉個體間活力差異較大有關(guān)。

表4 不同花粉授粉對種子發(fā)育的影響

圖2 不同花粉授粉所得的種子

不同授粉組合種子退化率，由低到高依次為：對照<由良×雞尾葡萄柚<由良×日本夏橙<由良×四季柚<由良×4倍體日本夏橙。由良×4倍體日本夏橙組合種子退化率極顯著高于其他3個組合，這可能與2倍體由良與4倍體花粉雜交產(chǎn)生3倍體種子，而3倍體種子多敗育有關(guān)，由良×4倍體日本夏橙組中有極少數(shù)飽滿種子，這部分種子可能是由良珠心細胞受4倍體日本夏橙花粉刺激產(chǎn)生的珠心胚；由良×雞尾葡萄柚與由良×四季柚組合種子退化率差異顯著；由良×雞尾葡萄柚與由良×日本夏橙以及由良×四季柚與由良×日本夏橙間差異均未達到顯著水平。總的來說，用雞尾葡萄柚、日本夏橙和四季柚花粉對由良進行授粉獲得的種子發(fā)育情況較好，4倍體日本夏橙花粉對由良授粉種子多退化敗育。

2.5 不同花粉授粉對果實品質(zhì)的影響

表5所示，由良×4倍體日本夏橙組合果實的單果重、果皮重、果皮厚在5組組合中均最高，其余組合從高至低依次為由良×日本夏橙、由良×四季柚、對照、由良×雞尾葡萄柚。雖然各組合果實可食率略有差異，但差異未達到顯著性水平。果形指數(shù)從高到低依次為：由良×雞尾葡萄柚、由良×4倍體日本夏橙、由良×日本夏橙、由良×四季柚、對照?？傮w來說，授粉種子數(shù)多的組合，單果重和果皮重下降、果皮變薄，果形指數(shù)上升，可能因為雞尾葡萄柚、四季柚花粉授粉提升了由良果實坐果率，使單個果實質(zhì)量下降；4倍體日本夏橙組果實坐果率低，單個果實質(zhì)量上升。

表5 不同花粉授粉對果實品質(zhì)的影響

3 討論

較多研究表明，異花授粉能影響果實坐果率。如藍云龍等[5]研究不同品種花粉對翡翠柚授粉，不同程度的提高了果實坐果率。王紹華等[6]的研究同樣得到異花授粉能提高水晶柚坐果率。本試驗采用雞尾葡萄柚、四季柚、日本夏橙和4倍體日本夏橙4種花粉對由良進行授粉，結(jié)果得到雞尾葡萄柚、四季柚、日本夏橙花粉授粉均不同程度提高由良果實坐果率。異花授粉提高由良果實的坐果率，可能是因為人工授粉增加了柱頭上附著的花粉數(shù)量，使果實的種子數(shù)增加，進而影響了果實內(nèi)各種激素含量和激素間的比例[7-10]，從而提高了果實的坐果率，本研究中結(jié)籽率高的授粉組合果實坐果率也高，也相應(yīng)的說明了這一點。本試驗4倍體日本夏橙花粉授粉對由良果實坐果率影響不顯著，可能是因為由良(2倍體)與4倍體日本夏橙花粉雜交產(chǎn)生3倍體，種子少，且多敗育，對果實內(nèi)各激素含量的影響程度低有關(guān)。

雞尾葡萄柚、四季柚、夏橙均為2倍體花粉，3個品種花粉活力差異不顯著，對由良進行授粉每個雜交組合果實結(jié)籽率和坐果率存在差異，其中以雞尾葡萄柚花粉授粉所得果實結(jié)籽率和坐果率均最高，說明溫州蜜柑品系由良結(jié)籽和坐果情況受父本品種影響較大。雞尾葡萄柚花粉對由良授粉得到的種子總數(shù)在所有組合中最多，但種子的干癟率亦較高，這可能與雞尾葡萄柚花粉活力個體間差異較大有關(guān)。

從4種花粉對由良授粉以及自然雜交組合中獲得果實的單果種子數(shù)和坐果率等方面考慮，本研究結(jié)果表明，對于雄性不育的溫州蜜柑品系，為獲得更多種子用于珠心苗培育，宜選用同為2倍體的雞尾葡萄柚花粉進行授粉。