李芳龍，阿呷爾布，李家東，梁曉霞*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院天然藥物研究中心，成都 611130；2.西藏大學(xué)藥學(xué)院，拉薩 850000）

自由基是含有不成對(duì)電子的一個(gè)原子或一組原子，自由基中奇數(shù)個(gè)電子使其不穩(wěn)定，壽命短且具有高反應(yīng)性[1]。不幸的是，氧氣非常容易形成自由基，而對(duì)于有氧生物，這可能會(huì)致命[2]。氧自由基會(huì)引起脂質(zhì)過氧化，從而導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，并可能導(dǎo)致過早衰老、癌癥和細(xì)胞死亡[3]?？寡趸瘎┛梢詭椭东@和中和自由基、有效清除活性自由基[4]，從而消除對(duì)人體的自由基損害，而且生物抗氧化能力與其抗病性、抗逆性和抗衰老性密切相關(guān)。近年來，合成抗氧化劑大量用于食品加工和醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域相關(guān)產(chǎn)品，但研究表明，如BHT、BHA等在作為抗氧化添加劑的同時(shí)，還有潛在的毒副作用。因此，從天然植物中找到有效的抗氧化劑并將其應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、保健品、飲料和化妝品等是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[5]。目前常用的天然抗氧化劑主要來自具有抗氧化作用的動(dòng)植物或其代謝產(chǎn)物，主要包括多酚、多糖、類黃酮和維生素等[6]。

水柏枝原植物為檉柳科水柏枝屬水柏枝（Myricaria gerynanica（L.）Desv.），藏醫(yī)稱翁布，生長(zhǎng)于海拔2 000～2 900 m的環(huán)境。它是一種落葉灌木，高1～2.5 m，莖直立，紅褐色分枝，線形或長(zhǎng)圓形葉，總狀花序，開花期6個(gè)月，有芽[6]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，其水提物具有一定程度的抗菌、抗氧化、抗疲勞和抗炎鎮(zhèn)痛作用[7]，但未見系統(tǒng)性研究，尤其對(duì)于其化學(xué)成分及其抗氧化活性的關(guān)系未闡明。因此，對(duì)水柏枝抗氧化能力進(jìn)行深入研究依然具有意義。本研究以藏藥水柏枝為研究對(duì)象，對(duì)其乙醇提取物的不同極性部位進(jìn)行體外抗氧化活性研究，并對(duì)不同溶劑提取物主要化學(xué)成分進(jìn)行定性及定量測(cè)定，以期為天然抗氧化劑的開發(fā)提供進(jìn)一步的理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 植物材料

藏藥水柏枝采自西藏日喀則，經(jīng)西藏大學(xué)藥學(xué)教師阿加爾布鑒定為檉柳科水柏枝屬水柏枝（Myricaria gerynanica（L.）Desv.）。

1.2 化學(xué)試劑

DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）（純度≥97%）和 ABTS（2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（純度≥98%）購自Solarbio（中國(guó)上海）。 BHT（二丁基羥基甲苯），購自南京建成科技有限公司。所有其他化學(xué)試劑均為分析純，購自中國(guó)成都科隆化工有限公司。

1.3 水柏枝不同溶劑提取物制備

取水柏枝適當(dāng)粉碎，加入30倍75%乙醇浸泡并超聲提取30 min，抽濾得到濾液。藥渣重復(fù)提取一次，將兩次濾液合并。然后將濾液減壓濃縮，得到膏狀藥材提取物，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，將萃取液中溶劑成分分別減壓濃縮，凍成干粉，備用。

1.4 植物化學(xué)成分定性鑒別

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)植物粗提物進(jìn)行植物化學(xué)評(píng)估，以確定是否存在黃酮類、皂素、多酚類、生物堿、香豆素、萜類、甾體和糖苷等。顏色或沉淀物形成的變化表示對(duì)這些測(cè)定的陽性反應(yīng)[8-10]。

①黃酮類化合物：在1 mL樣品中加入適量鎂粉振搖，滴入幾滴濃鹽酸，1～2 min，即顯出顏色，一般呈紅色到紫紅色，個(gè)別顯藍(lán)或綠色。

②皂素：將1 mL樣品在10 mL水中煮沸幾分鐘，過濾并振搖，產(chǎn)生持續(xù)的泡沫表明存在皂苷。

③酚類檢測(cè)：在1 mL樣品中加入FeCl3溶液1～2滴，若有藍(lán)紫、紫紅色反應(yīng)，則說明含有酚類物質(zhì)。

④生物堿類檢測(cè)：在1 mL樣品加入5滴碘化鉍鉀溶液，混勻。若有棕紅色沉淀，靜置后出現(xiàn)白色絮狀沉淀，說明含有生物堿類物質(zhì)。

⑤香豆素：將1 mL樣品放入有用稀氫氧化鈉溶液潤(rùn)濕的濾紙的試管中，然后將試管放在沸騰的水浴中幾分鐘，取出紙張并將其暴露在紫外線下，黃綠色熒光表明存在香豆素。

⑥萜類化合物：將1 mL樣品用1 mL乙酸酐，1 mL三氯甲烷和1 mL硫酸處理，產(chǎn)生紫色表明存在萜類化合物。

⑦甾體：將1 g樣品溶于冰醋酸，加入醋酐-濃硫酸（20∶1），反應(yīng)液顏色由紅→紫→藍(lán)→綠→污綠，發(fā)生一系列變化，最后褪色，則說明存在甾體。

⑧糖苷：將1 mL樣品與0.2 mL乙醇-萘酚（20%）混合，沿試管壁加入2毫升硫酸，形成2層，兩層交界處的紫色區(qū)域表示存在糖苷。

1.5 總酚含量的測(cè)定

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)，通過Folin-Ciocalteu's比色法分別測(cè)量了水柏枝粗提物及各極性部位的總酚含量。取將干燥后的樣品配置成0.25 mg/mL的溶液，取1 mL樣品溶液與1 mL Folin-Ciocalteu's試劑（0.1 mol/L）混合，1 min后，加入1 mL 10%碳酸鈉水溶液，然后用蒸餾水稀釋至25 mL。在室溫下放置30 min后，在754 nm處測(cè)定吸光度[11]。

1.6 總黃酮含量的測(cè)定

用三氯化鋁比色法測(cè)定粗提物中總黃酮的含量。將干燥后的樣品配置成0.25 mg/mL的溶液，取200 μL 加入 5%NaNO2溶液 0.2 mL，靜置 6 min，加入0.2 mL的10%AlCl3溶液，靜置6 min，加入2 mL的1 moL/L的NaOH溶液，然后將最終體積的混合物用蒸餾水稀釋至10 mL。將混合物靜置15 min后，在510 nm處測(cè)量吸光度。從校準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量[12-13]，結(jié)果表示為 mg/g。

1.7 體外抗氧化活性測(cè)定

1.7.1 DPPH清除率

取100 mg乙醇提取物和100 mg BHT，用70%乙醇稀釋至10mL容量瓶中，制成母液。取2.4mgDPPH，用70%乙醇溶解并稀釋至50 mL容量瓶中使用。將樣品溶液和對(duì)照溶液多次稀釋以獲得一系列濃縮溶液。向EP管中加入1 mL DPPH溶液，其中分別含1 mL樣品溶液和對(duì)照溶液。搖動(dòng)后，在20℃水浴中反應(yīng)30 min，然后在517 nm下測(cè)量吸光度Aj。使用70%乙醇代替DPPH，另一個(gè)與樣品組相同操作，以獲得吸光度Ai。取70%的乙醇代替樣品溶液，添加1 mL DPPH，在20℃水浴中反應(yīng)30 min，在517 nm處測(cè)定吸光度 A0。DPPH 清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%[14-15]

1.7.2 ABTS清除率

配置7.4 mmoL/L ABTS溶液10 mL，2.6 mmoL/L K2S2O8溶液10 mL。將0.6 mL 7.4 mmoL/L ABTS溶液和0.6 mL 2.6 mmoL/L K2S2O8溶液混合，在室溫避光條件下靜置過夜，將所得的溶液用無水乙醇稀釋，使其在30℃，734 nm波長(zhǎng)下的吸光度為0.7±0.2，即得到ABTS工作液。取上述樣品母液和對(duì)照品母液按上述相同倍比稀釋，得到一系列濃度溶液。取0.8mL ABTS工作液和0.2 mL樣品溶液以及對(duì)照液搖勻混合，靜置6 min，在734 nm處測(cè)得吸光度Ai。取0.8 mL 70%乙醇溶液和0.2 mL樣品溶液搖勻混合，靜置6 min，在734 nm處測(cè)得吸光度Aj。取0.8 mL ABTS工作液和0.2mL70%乙醇溶液搖勻混合后，靜置6min，在734 nm處測(cè)得吸光度A0。ABTS自由基清除率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%[16-17]。

1.7.3 總還原能力

1 mL樣品與2.5 mL磷酸鹽緩沖液（0.2 moL/L，pH=6.6）和 2.5 mL 1%K3Fe（CN）6混合，并在 50 ℃水浴20 min，然后加入2.5 mL的10%（w/v）三氯乙酸并離心（15 000×g，10 min）。離心后，取上清液 2.5 mL，與2.5 mL H2O和0.5 mL 0.1%FeCl3混合。在700 nm處測(cè)量吸光度[18]。

2 結(jié)果和討論

2.1 植物化學(xué)分析

化學(xué)成分預(yù)示結(jié)果如表1所示，水柏枝乙醇提取物及其不同極性部位提取物中均含有黃酮類和糖苷類成分，但均不含生物堿成分。皂素主要分布于二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇中，其中在二氯甲烷部位最多；酚類主要分布乙酸乙酯和正丁醇部位；香豆素類主要集中在乙酸乙酯部位；萜類以及甾體主要分布在石油醚和二氯甲烷部位。

表1 植物化學(xué)分析定性鑒別結(jié)果Table 1 The consequence of preliminary phytochemical screening

2.2 多酚含量測(cè)定

2.2.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照1.5的方法，得到?jīng)]食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，回歸方程為 y=0.057 1x+0.031 1，r2=0.999 0，說明濃度與吸光度的線性關(guān)系較好，可用于多酚含量的測(cè)定。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 The standard curve of gallic acid

2.2.2 多酚含量測(cè)定

水柏枝乙醇提取物及其不同極性部位中均含有一定量的多酚成分，其含量如表2所示，其乙酸乙酯部位的多酚含量最高（94.43±1.5）mg/g，其余含量依次為：二氯甲烷部位＞正丁醇部位＞水部位＞石油醚部位。

表2 多酚含量測(cè)定結(jié)果Table 2 The consequence of polyphenol content determination

2.3 總黃酮含量測(cè)定

2.3.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照1.6的方法，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，回歸方程為 y=0.001 81x+0.073 1，r2=0.999 6，說明濃度與吸光度的線性關(guān)系較好，可用于黃酮含量的測(cè)定。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 The standard curve of rutin

2.3.2 黃酮含量

水柏枝乙醇提取物及其不同極性部位中均含有一定量的黃酮類成分，其含量如表3所示，其中乙酸乙酯部位中總黃酮含量最高，水相中最少。從醇提物中的269.66 mg/g到乙酸乙酯中的627.21 mg/g，總黃酮含量提高了兩倍以上，可見通過梯度萃取實(shí)現(xiàn)了黃酮類成分的有效富集。

表3 總黃酮含量測(cè)定結(jié)果Table 3 The consequence of flavonoids content determination

2.4 抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力

DPPH法是一種評(píng)價(jià)自由基清除能力廣泛而簡(jiǎn)單的方法，能用于溶于乙醇水溶液樣品的測(cè)定。水柏枝乙醇提取物和不同極性部位提取物均有不同程度的DPPH清除率能力，且在所測(cè)濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出劑量相關(guān)性（見圖3）。其中乙酸乙酯部位（IC50=5.00 μg/mL±0.10 μg/mL）的清除率最佳，水部位（IC50=11.00 μg/mL±0.96 μg/mL）和正丁醇部位（29.67 μg/mL±0.47 μg/mL）次之，乙醇提取物（IC50=46.01 μg/mL±0.52 μg/mL 優(yōu)于二氯甲烷部位（IC50=89.67 μg/mL±9.03 μg/mL）和石油醚部位（IC50=1 422.67 μg/mL±443.68 μg/mL）。除石油醚部位外，其他5種提取物當(dāng)濃度達(dá)到0.625 mg/mL以上時(shí)，其DPPH自由基清除率明顯高于BHT。

圖3 水柏枝乙醇提取物不同極性部位的DPPH清除率Figure 3 The DPPH scavenging of different polarity part of ethanol extract from Myricaria gerynanica （L.） Desv.

2.4.2 ABTS自由基清除能力

ABTS另一種常用的人工合成自由基，用于測(cè)定抗氧化能力，適用于極性和非極性化合物，反應(yīng)時(shí)間較DPPH短，是使用最多的方法之一。水柏枝乙醇提取物和不同極性部位提取物均不同程度的具有ABTS清除率能力，且在所測(cè)濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出劑量相關(guān)性（見圖4）。乙酸乙酯部位（IC50＜9.00 μg/mL±0.61 μg/mL）的自由基清除能力最強(qiáng)，優(yōu)于陽性對(duì)照BHT（IC50=215.00 μg/mL±9.23 μg/mL），正丁醇部位（18.00 μg/mL±0.59 μg/mL）和二氯部位（34.33 μg/mL±0.01μg/mL）次之，水部位（IC50=107.24μg/mL±0.03μg/mL）再次，而乙醇提取物（IC50=284.00 μg/mL±0.54 μg/mL）的ABTS自由基清除能力僅優(yōu)于石油醚部位（IC50=487.33 μg/mL±0.09 μg/mL）。

圖4 水柏枝乙醇提取物不同極性部位的ABTS清除率Figure 4 The ABTS scavenging of different polarity part of ethanol extract from Myricaria gerynanica （L.） Desv.

2.4.3 總還原能力

抗氧化劑能使鐵氰化鉀的三價(jià)鐵還原成二價(jià)亞鐵氰化鉀，二價(jià)鐵進(jìn)一步和三氯化鐵的反應(yīng)下生成在700 nm處有最大吸光度的普魯士藍(lán)，因此測(cè)定700 nm處吸光度的高低可以間接反映抗氧化劑的還原能力的大小，吸光度越大還原能力越強(qiáng)。水柏枝乙醇提取物和不同極性部位提取物總還原能力基本呈劑量依賴性（見圖5）。乙醇提取物的總抗氧化能力比BHT弱，但其活性極性部分乙酸乙酯部位的總還原能力在低濃度時(shí)略低于BHT，在最高濃度時(shí)，優(yōu)于BHT，正丁醇部位次之，其余部位效果較差。

圖5 水柏枝乙醇提取物不同極性部位的總還原能力Figure5 The total reducing power of different polarity part of ethanol extract from Myricaria gerynanica （L.） Desv.

3 討論與結(jié)論

植物化學(xué)分析顯示水柏枝醇提物中不同程度的含有多酚、黃酮、香豆素、甾體、糖苷等類化合物，其中黃酮類在水柏枝的各個(gè)極性部位均有分布，酚類主要分布在乙酸乙酯部位，皂素主要分布于二氯甲烷部位，香豆素類主要集中在乙酸乙酯部位；萜類以及甾體主要分布在石油醚和二氯甲烷部位。DPPH、ABTS、總還原能力3個(gè)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，水柏枝乙酸乙酯部位的抗氧化活性最佳，優(yōu)于陽性對(duì)照BHT；正丁醇部位次之。其中乙酸乙酯部位中多酚及總黃酮含量最高，正丁醇部位中二者含量也均較高。由于黃酮類屬于酚類，而酚類化合物是植物中最重要且分布最廣泛的物質(zhì)之一，由于其結(jié)構(gòu)中含有較多的羥基，因此它們具有天然的抗氧化活性[19-20]，因此可以推斷水柏枝不同極性部位抗氧化活性與其中多酚及黃酮類成分含量相關(guān)，而梯度萃取實(shí)現(xiàn)了水柏枝醇提物中抗氧化成分的富集，使水柏枝醇提物當(dāng)中具有抗氧化作用的成分比如多酚黃酮類主要集中在乙酸乙酯部位。綜上分析可以得出，水柏枝乙醇提取物不同極性部位均有一定的抗氧化活性，其中乙酸乙酯部位活性最佳，且優(yōu)于BHT，有望開發(fā)成為天然抗氧化劑。