焦?jié)杀?，陳子豪，?謠，譚 波，李 晗，游成銘，王麗霞，劉思凝，徐振鋒，張 麗

（長(zhǎng)江上游林業(yè)生態(tài)工程四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/長(zhǎng)江上游森林資源保育與生態(tài)安全國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/高山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站/四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)林業(yè)研究所，成都 611130））

土壤酶主要由微生物和植物產(chǎn)生，可以有效促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的分解，在土壤碳、氮、磷等元素循環(huán)中發(fā)揮重要作用[1]。土壤微生物通過(guò)胞外酶將養(yǎng)分由有機(jī)態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)態(tài)，改變土壤的養(yǎng)分有效性[2]。目前研究通常將各相關(guān)土壤酶之間的比值與養(yǎng)分元素相聯(lián)系，以此來(lái)評(píng)價(jià)微生物的相對(duì)養(yǎng)分限制，繼而提出酶化學(xué)計(jì)量理論。R.L.Sinsabaugh等[3]研究發(fā)現(xiàn)，在全球尺度上，土壤C、N、P酶化學(xué)計(jì)量比總體上呈1∶1∶1的關(guān)系，該理論揭示了土壤微生物養(yǎng)分需求與土壤養(yǎng)分有效性之間生物地球化學(xué)平衡模式，并作為檢測(cè)及評(píng)價(jià)微生物代謝及生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分限制的有效工具而成為目前研究熱點(diǎn)之一。土壤酶活性及其計(jì)量比不僅受到土壤水熱條件和pH等環(huán)境因子的影響[4]，同時(shí)還與凋落物的降解及其對(duì)土壤的養(yǎng)分歸還直接相關(guān)[5]。森林凋落物是土壤有機(jī)質(zhì)的主要來(lái)源，可有效維護(hù)土壤生態(tài)功能的發(fā)揮[6]。大量研究證實(shí)，自然或人為驅(qū)動(dòng)控制凋落物輸入與分解變化能深刻影響森林生態(tài)系統(tǒng)地下生態(tài)功能[7]。如付淑月等[8]指出黃土丘陵區(qū)地上凋落物去除使得土壤有機(jī)碳含量顯著增加，但也有研究表明添加凋落物后土壤有機(jī)碳沒(méi)有發(fā)生變化[9]。此外，王俊龍等[10]通過(guò)研究表明，凋落物對(duì)于不同土壤酶活性有著不同的促進(jìn)或抑制作用；P.S.Kourtev等[6]也指出凋落物的組成和性質(zhì)是影響酶活性的主要因素。但由于不同區(qū)域不同的地理?xiàng)l件，土壤酶活性及其計(jì)量比對(duì)凋落物的響應(yīng)結(jié)果也不同，主要受到生態(tài)系統(tǒng)、微生物組成和土壤養(yǎng)分等生物及非生物因素的影響[9]。因而，研究高山地區(qū)森林生態(tài)系統(tǒng)凋落物與土壤酶活性及其計(jì)量比之間的相關(guān)關(guān)系，對(duì)于探究森林物質(zhì)循環(huán)過(guò)程有重要的指示作用。

川西高山森林位于長(zhǎng)江上游和青藏高原東緣，特殊的地理位置使得其在水源涵養(yǎng)、調(diào)節(jié)氣候和生物多樣性保育等方面具有十分重要的作用和地位[11]。同時(shí)，由于受長(zhǎng)期的低溫和頻繁的地質(zhì)災(zāi)害影響，該區(qū)森林土壤具有土層淺薄和凋落物分解緩慢的特點(diǎn)[12]，因而其相應(yīng)生態(tài)過(guò)程也受到普遍的關(guān)注。目前已有的研究更加注重氮沉降[13]、凋落物產(chǎn)量[14]和凋落物養(yǎng)分歸還[15]等，而關(guān)于該地區(qū)凋落物對(duì)土壤酶活性以及養(yǎng)分限制的影響機(jī)制尚不清楚。因此，本文以川西高山四川紅杉-岷江冷杉針葉林為對(duì)象，通過(guò)凋落物去除控制實(shí)驗(yàn)，研究了森林土壤C、N、P分解相關(guān)酶活性及其化學(xué)計(jì)量比對(duì)凋落物去除的響應(yīng)，以期為了解該地區(qū)森林土壤生態(tài)過(guò)程及相應(yīng)經(jīng)營(yíng)管理提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)域位于四川省阿壩藏族羌族自治州理縣畢棚溝四川農(nóng)業(yè)大學(xué)高山森林生態(tài)系統(tǒng)定位研究站（102.88°E～102.95°E，31.23°N～31.32°N，海拔2 458～4 619 m），該區(qū)域地處中亞熱帶季風(fēng)氣候向大陸性高原氣候過(guò)渡地區(qū)，由于其獨(dú)特的高原地形，氣候冬寒夏涼，常年干燥。年降水量約850 mm，降水主要集中在5—8月，氣溫變化劇烈，年均氣溫為2～4℃，最高氣溫在7月（23℃），最低氣溫在1月（-18℃）。由于冬季氣溫較低，每年11月至次年4月為降雪期，12月下旬至次年3月為雪被完全覆蓋期，4月開(kāi)始?xì)鉁鼗嘏┍婚_(kāi)始融化。該區(qū)域以四川紅杉（Larix mastersiana）、岷江冷杉（Abies faxoniana）和川西云杉（Picea likiangensis）為主要建群種，林下灌木主要有康定柳（Salix paraplesia）、高山杜鵑（Rhododendron lapponicun）和沙棘（Hioopphae rhamnoides）等[16]。

1.2 樣地設(shè)置

在研究區(qū)域內(nèi)選取四川紅杉-岷江冷杉原始林（海拔3 589 m）作為研究樣地開(kāi)展相關(guān)實(shí)驗(yàn)。2018年9月，在該樣地內(nèi)選取坡度、坡位及坡向等相似的10 m×10 m的樣方3個(gè)。在每個(gè)樣方內(nèi)安裝60個(gè)內(nèi)徑20 cm、高15cm的PVC環(huán)，相鄰PVC環(huán)間距0.50 m，嵌入土壤深度為10 cm。其中30個(gè)PVC環(huán)用可透水透氣但避免凋落物輸入的圓形尼龍遮蓋網(wǎng)（網(wǎng)孔為2 mm）遮蓋，用以去除凋落物；另外30個(gè)PVC環(huán)未做遮蓋處理，作為凋落物自然輸入。

分別于凋落物去除1 a（2019年9月下旬）和2 a（2020年9月下旬）進(jìn)行土樣采集。每次采集樣方內(nèi)凋落物自然輸入及去除凋落物的完整PVC環(huán)各3個(gè)，共計(jì)18個(gè)（3樣方×3重復(fù)×2處理），用4℃ 冰盒保存并立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。剔除土壤中的石塊、動(dòng)植物殘?bào)w、根系及凋落物等后過(guò)2 mm篩，并將土樣分為兩部分，其中一部分進(jìn)行風(fēng)干用于土壤理化性質(zhì)的測(cè)定，另一部分保存鮮樣并用于測(cè)定土壤含水量及土壤酶活性。

1.3 土壤指標(biāo)測(cè)定

采用埋設(shè)紐扣式溫度計(jì)（DS1921G）記錄土壤溫度，頻率為每3 h記錄一次；土壤pH用去CO2的蒸餾水（土水比為1∶2.5）浸提10 g風(fēng)干土樣后，用pH儀（PHS-25CW）直接測(cè)定；稱取10 g新鮮土樣在105℃下烘至恒重測(cè)定土壤含水量（SWC）；土壤全碳（TC）采用高溫外熱重鉻酸鉀氧化法、全氮（TN）采用凱氏定氮法、全磷（TP）含量的測(cè)定采用鉬銻鈧比色法；銨態(tài)氮（NH4+-N）采用靛酚藍(lán)比色法，硝態(tài)氮（NO3--N）采用雙波長(zhǎng)法進(jìn)行測(cè)定（表1）[17]，參照陳子豪等的酶標(biāo)版法測(cè)定與土壤C、N、P分解相關(guān)的7 種酶活性[18-19]。

表1 土壤理化因子對(duì)凋落物去除的響應(yīng)Table 1 Response of soil physical and chemical factors to litter removal

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用 SPSS 20.0（IBM SPSS Statistics，Chicago，IL，USA）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Independent-samples t test）分析相同時(shí)期不同凋落物處理及相同凋落物處理不同時(shí)期土壤酶活性的差異，顯著性水平設(shè)為P=0.05；利用雙因素（Twoway ANOVA）方差分析檢驗(yàn)凋落物去除、采樣時(shí)間及二者交互作用對(duì)土壤酶活性及化學(xué)計(jì)量比的影響；采用Pearson相關(guān)分析土壤酶活性及化學(xué)計(jì)量比與土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系；并使用Origin Pro 2018（OriginLab，Northampton，MA，USA）軟件進(jìn)行繪圖。

酶化學(xué)計(jì)量表示如下[20]：

（1）C ∶NEEA=lnBG/ln（LAP+NAG）

（2）C∶PEEA=lnBG/lnAP

（3）N ∶PEEA=ln（LAP+NAG）/lnAP

（4）Vector L={[lnBG/ln（NAG+LAP）]2+（lnBG/lnAP）2}1/2

（5）Vector A=Degrees{ATAN2[lnBG/lnAP，lnBG/ln（NAG+LAP）]}

其中 C ∶NEEA，C ∶PEEA，N ∶PEEA分別表示土壤酶化學(xué)計(jì)量碳氮比、碳磷比以及氮磷比，VectorL越長(zhǎng)表示微生物相對(duì)養(yǎng)分碳限制越大，VectorA＜45°表示微生物相對(duì)氮限制的程度，VectorA＞45°表示微生物相對(duì)磷限制的程度[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤酶活性對(duì)凋落物去除的響應(yīng)

凋落物去除僅在采樣第一年顯著降低了多酚氧化酶的活性（降低了36.90%），而在采樣第二年顯著增加了纖維二糖水解酶和亮氨酸氨基肽酶的活性（圖1）。采樣時(shí)間顯著影響了土壤酶活性（圖1，表2）。在凋落物自然輸入處理中，與采樣第一年相比，采樣第二年的酸性磷酸酶、纖維二糖水解酶和多酚氧化酶活性顯著降低（分別降低了89.60%、82.52%和 81.48%），而 β-葡萄糖苷酶和過(guò)氧化物酶活性則顯著升高。在凋落物去除處理下，與采樣第一年相比，凋落物去除兩年時(shí)酸性磷酸酶活性顯著降低（降低了88.91%），而纖維二糖水解酶活性顯著提高?？偟膩?lái)說(shuō)，該區(qū)域內(nèi)針葉林凋落物去除對(duì)不同土壤酶活性的影響具有差異。

圖1 土壤酶活性對(duì)凋落物去除的響應(yīng)Figure 1 Response of soil enzyme activity to litter removal

表2 采樣時(shí)間和凋落物處理及其交互作用對(duì)土壤酶活性及其計(jì)量比的雙因素方差分析Table 2 Two-way ANOVA of Time，Litter and their interaction on soil enzyme activity and its stoichiometric ratio

2.2 土壤酶化學(xué)計(jì)量比對(duì)凋落物去除的響應(yīng)

凋落物去除對(duì)土壤酶化學(xué)計(jì)量比的影響較?。▓D2，表2），僅在采樣第一年顯著增加了C∶PEEA。而采樣時(shí)間對(duì)土壤酶化學(xué)計(jì)量比的影響較大（圖2，表2），其中，在凋落物自然輸入處理中，采樣第二年土壤 C∶NEEA、C∶PEEA和 N∶PEEA均顯著提高；而在凋落物去除處理中，采樣第二年N∶PEEA也顯著提高。同時(shí)，本研究中C∶NEEA及1 a時(shí)期的C∶PEEA低于全

圖2 土壤酶化學(xué)計(jì)量比對(duì)凋落物去除的響應(yīng)Figure 2 Response of soil enzyme stoichiometry to litter removal

球平均值（1.41、0.62），N∶PEEA及 2 a時(shí)期的 C∶PEEA均高于全球平均值（0.44、0.62），表明該地區(qū)N轉(zhuǎn)化酶活性相對(duì)較高，C、P轉(zhuǎn)化酶活性相對(duì)較低。

微生物相對(duì)養(yǎng)分限制對(duì)凋落物去除的響應(yīng)較小，僅在采樣第一年顯著增加了微生物相對(duì)養(yǎng)分碳限制（圖3，表2）。采樣時(shí)間對(duì)土壤微生物相對(duì)養(yǎng)分限制有顯著影響，與采樣一年時(shí)期相比，采樣第二年微生物相對(duì)養(yǎng)分C、N限制增加，而減少了微生物相對(duì)養(yǎng)分P限制。

圖3 微生物相對(duì)養(yǎng)分限制對(duì)凋落物去除的響應(yīng)Figure 3 Response of microbial relative nutrient limitation to removal

2.3 土壤酶活性及其計(jì)量比的影響因素

相關(guān)性及逐步回歸分析結(jié)果顯示，β-葡萄糖苷酶活性與土壤含水量、土壤C含量以及土壤銨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)，其中銨態(tài)氮含量對(duì)β-葡萄糖苷酶活性變異的解釋量為79.6%（表3、表4）。亮氨酸氨基肽酶活性與土壤含水量、土壤N含量、土壤銨態(tài)氮以及硝態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)，其中土壤含水量對(duì)亮氨酸氨基肽酶活性變異的解釋量為 42%（表3、表4）。β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性與土壤含水量、土壤C、N含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，其中土壤C含量對(duì)β-N-乙酰葡萄糖苷酶活性變異的解釋量為 67.3%（表3、表4）。C∶NEEA與 C∶N 呈顯著正相關(guān)關(guān)系；C ∶PEEA、N ∶PEEA分別與土壤 C ∶P以及土壤銨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系；而VectorA則與土壤C∶P以及土壤銨態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)（表3）。

表3 土壤酶活性及其化學(xué)計(jì)量比與土壤理化因子的相關(guān)關(guān)系Table 3 Correlation between soil enzyme and its stoichiometric ratio and soil physical and chemical factors

表4 土壤酶活性及其計(jì)量比、土壤理化因子的回歸分析Table 4 Regression analysis of soil enzyme activity and its measurement ratio，soil physical and chemical factors

3 討論與結(jié)論

3.1 土壤酶活性對(duì)凋落物去除的響應(yīng)

作為與土壤C、N分解相關(guān)的土壤酶，纖維二糖水解酶與亮氨酸氨基肽酶對(duì)凋落物去除及去除時(shí)間的交互作用產(chǎn)生顯著響應(yīng)，且二者均在凋落物處理兩年時(shí)期表現(xiàn)出凋落物去除顯著大于凋落物自然輸入處理，表明該區(qū)域C、N分解相關(guān)酶活性對(duì)凋落物去除的響應(yīng)較為遲緩。四川紅杉-岷江冷杉為該地區(qū)較為典型的針葉林，凋落葉的C/N較大，分解較慢，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的分解后，組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，難降解物質(zhì)逐步轉(zhuǎn)化為易降解物質(zhì)[21]，使得后期不同處理土壤的養(yǎng)分含量產(chǎn)生差異，因而酶活性在凋落物處理兩年時(shí)期的差異較大。酸性磷酸酶作為與磷轉(zhuǎn)化相關(guān)的土壤酶，能很好地反映土壤磷素的轉(zhuǎn)化與需求。本研究中酸性磷酸酶受采樣時(shí)間的顯著影響，且在采樣第二年顯著降低。由于土壤酸性磷酸酶與有效磷呈負(fù)相關(guān)[22]，說(shuō)明該地區(qū)土壤有效磷含量可能逐漸增加。此外，凋落物去除一年時(shí)多酚氧化酶活性顯著降低，且多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶對(duì)凋落物去除時(shí)間的響應(yīng)不同。土壤多酚氧化酶和過(guò)氧化物酶都屬于氧化還原酶，二者與土壤腐殖化程度相關(guān)[23]。由于無(wú)新鮮凋落物的輸入，腐殖質(zhì)的合成受限，因而凋落物去除一年時(shí)多酚氧化酶活性顯著降低。隨著地下生態(tài)過(guò)程的進(jìn)行，凋落物去除與自然輸入之間腐殖質(zhì)含量出現(xiàn)差異。同時(shí)，隨著凋落物去除時(shí)間的增加，土壤微環(huán)境發(fā)生變化，土壤微生物生物量、區(qū)系組成以及代謝過(guò)程等發(fā)生改變，從而使得土壤微生物產(chǎn)生的土壤酶數(shù)量及活性發(fā)生變化[24]，導(dǎo)致不同土壤酶對(duì)不同凋落物去除時(shí)期產(chǎn)生的響應(yīng)不同。

3.2 土壤酶化學(xué)計(jì)量比對(duì)凋落物去除的響應(yīng)

生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量可以反映微生物相對(duì)養(yǎng)分的需求狀況[25]。根據(jù)生態(tài)經(jīng)濟(jì)學(xué)最佳配置原則[26]，微生物會(huì)把更多目標(biāo)集中在所缺乏的資源上，而該地區(qū)的N轉(zhuǎn)化酶活性較高，反映出該區(qū)域N元素缺乏。這與前人在川西高山森林生態(tài)系統(tǒng)研究結(jié)果一致[13，27]。一般情況下，凋落物的質(zhì)和量會(huì)改變森林土壤的養(yǎng)分狀況，微生物會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)土壤生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量來(lái)調(diào)控對(duì)自身生長(zhǎng)的養(yǎng)分利用[28]。根據(jù)前人研究，該地區(qū)9—10月為針葉林凋落物高峰期[14]，由于無(wú)新鮮有機(jī)質(zhì)的輸入，導(dǎo)致凋落物去除一年后微生物相對(duì)養(yǎng)分碳限制差異顯著。同時(shí)，微生物相對(duì)養(yǎng)分限制也表明在該區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中，P限制逐漸減小，有效磷含量逐漸增加，且該區(qū)域逐漸由磷限制向氮限制轉(zhuǎn)變，促進(jìn)了該生態(tài)系統(tǒng)的氮循環(huán)。

3.3 土壤酶及其化學(xué)計(jì)量比的影響因素

土壤酶作用的發(fā)揮通常受限于各種環(huán)境因子[29]。相關(guān)性分析顯示土壤含水量、全C、全N及有效氮與土壤C、N分解酶活性顯著相關(guān)（表3）。有研究表明，降水的增加會(huì)導(dǎo)致β-N-乙酰葡萄糖苷酶等酶活性增加[30]。同時(shí)，微生物對(duì)于有機(jī)質(zhì)的利用具有一定的選擇性，更傾向于利用易分解的有機(jī)質(zhì)，導(dǎo)致土壤碳氮含量變化成為影響土壤酶活性的重要因素[31]。此外，土壤銨態(tài)氮含量與土壤酶化學(xué)計(jì)量比的相關(guān)性較高，土壤銨態(tài)氮含量可被認(rèn)為是該地區(qū)針葉林中影響土壤養(yǎng)分限制的主要因子。

綜上所述，川西高山地區(qū)C、N、P分解相關(guān)土壤酶活性對(duì)于凋落物去除的響應(yīng)不顯著，但會(huì)受到凋落物去除時(shí)間及二者交互作用的綜合影響，土壤C、N分解相關(guān)酶活性對(duì)凋落物的影響較為遲緩。土壤含水量及C、N含量是影響土壤C、N分解酶隨不同時(shí)期及凋落物處理產(chǎn)生差異的主要因素。生態(tài)酶化學(xué)計(jì)量指出川西高山針葉林處于微生物代謝相對(duì)P限制減小而N限制增加的區(qū)域。森林凋落物作為森林生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其分解是土壤有機(jī)質(zhì)的重要輸入源，并對(duì)土壤生態(tài)過(guò)程具有一定的調(diào)控作用，關(guān)于該區(qū)域凋落物去除實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)行進(jìn)一步長(zhǎng)期研究。