楊濟(jì)源，秦紀(jì)洪

（1.四川大學(xué)建筑與環(huán)境學(xué)院，成都 610065；2.成都大學(xué)建筑與土木工程學(xué)院，成都 610106））

氮素是陸地生態(tài)系統(tǒng)元素循環(huán)中重要組成部分，同時(shí)也是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)物質(zhì)，是評估當(dāng)前和未來森林生產(chǎn)力的關(guān)鍵[1]。高海拔土壤儲(chǔ)存著大量的氮（N），有機(jī)氮和無機(jī)氮是森林土壤氮庫中兩種主要存在形式，其中有機(jī)氮含量占到了93%以上[2]。海拔的變化造成了溫度、濕度和太陽輻射等非生物因素的梯度，這些因素反過來影響森林組成和土壤有機(jī)氮[3]。川西高原由于陡峭的海拔梯度，在短距離內(nèi)具有不同的森林類型進(jìn)而形成自森林線（郁閉森林分布上限）到喬木線（喬木分布上限），介于亞高山針葉林與高山喬灌之間的高山樹線群落交錯(cuò)帶（alpinetreeline ecotone，ATE）。ATE常年處于氮限制狀態(tài)和低溫閾值，應(yīng)對全球變化響應(yīng)敏感，這使其氮過程更容易受到氣候擾動(dòng)且比在低海拔地區(qū)更為迅速和嚴(yán)重[4]。

土壤池可以被分離為微生物可獲得的顆粒態(tài)有機(jī)質(zhì)（particulate organic matter，POM）和礦物保護(hù)和微生物不可獲得的礦物伴生有機(jī)質(zhì)（mineral-associated organic matter，MAOM）[5]。一般來說，POM 中的有機(jī)氮（particulate organic nitrogen，PON）是不穩(wěn)定的、快速周轉(zhuǎn)的氮，被認(rèn)為是土壤中氮的“活性”來源[6]。有研究表明，受海拔升高的影響會(huì)分別導(dǎo)致土壤有機(jī)氮含量分別表現(xiàn)為降低[7]、單峰增加[8]和增加[9]的情況，在高海拔地區(qū)多表現(xiàn)為增加[10-11]。Tan W.等[12]研究發(fā)現(xiàn)，氣候變化會(huì)不同程度上影響土壤團(tuán)聚體有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化，影響強(qiáng)度隨土壤粒徑變化?？偟膩碚f，氣候變化對土壤有機(jī)氮的影響很大程度上依賴于土壤團(tuán)聚體的理化性質(zhì)。但是鮮有研究表明哪一組分土壤團(tuán)聚體對有機(jī)氮含量變化貢獻(xiàn)較大[13]。MAOM通過與礦物的關(guān)聯(lián)來穩(wěn)定氮素形成礦物態(tài)有機(jī)氮（mineral-associated organic nitrogen，MAON），礦物相關(guān)組分積累會(huì)使丟失氮的速度變慢，所以礦物結(jié)合態(tài)土壤組分間的轉(zhuǎn)化以及各組分有機(jī)質(zhì)的礦化是土壤有機(jī)質(zhì)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)[14]。以前MAOM因其穩(wěn)定性被普遍認(rèn)為其轉(zhuǎn)化是一種長期過程。然而，近期證據(jù)表明，除對短期響應(yīng)最顯著的POM之外，MAOM也能對土壤擾動(dòng)的變化做出響應(yīng)，也會(huì)對植物和微生物的氮?jiǎng)討B(tài)產(chǎn)生影響[15]。MAOM中不同氮組分活性不同，其組成會(huì)影響氮穩(wěn)定性，深入認(rèn)識(shí)土壤氮活性特征對預(yù)測全球變化背景下土壤環(huán)境效應(yīng)是必要的。目前多采用物理[16]、化學(xué)或物理-化學(xué)法[17]針對土壤氮不同活性組分進(jìn)行分級。目前有關(guān)氮?jiǎng)討B(tài)的研究集中在人工生態(tài)系統(tǒng)和低海拔生態(tài)系統(tǒng)，而針對全球變化背景下高寒土壤生態(tài)系統(tǒng)氮空間分布特征的相關(guān)研究工作并不多，且對于ATE動(dòng)態(tài)變化對高寒生態(tài)系統(tǒng)和MAON的相關(guān)研究更為缺乏。高寒土壤氮組成因海拔導(dǎo)致環(huán)境因子變化的影響而分異，因此，本研究旨在利用土壤物理-化學(xué)分級的方法，揭示ATE海拔梯度對土壤團(tuán)聚體結(jié)構(gòu)、礦物結(jié)合態(tài)氮及其分配的影響，以期為深入探究礦物結(jié)合態(tài)有機(jī)質(zhì)礦化的差異和相互關(guān)系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究區(qū)自然概況

研究區(qū)地處四川省阿壩藏族羌族自治州夢筆山西南坡瑪嘉溝，由大雪山和邛崍山系交界北部地段多個(gè)高峰組成，海拔均達(dá)4 000 m以上，土壤從下至上分別為山地棕色針葉林土及高寒草甸土。川西（青藏高原東緣和橫斷山區(qū)）高山樹線（ATE）一般介于海拔3 800～4 200 m，在較小海拔梯度范圍內(nèi)生態(tài)環(huán)境有極大變化，隨海拔高度升高，植被的類型以及微氣候均會(huì)隨之劇烈變化。該區(qū)域氣候?qū)儆诟吆畾夂颍杲邓?00～1 100 mm，涵蓋了從針葉林到高山灌叢，高山草甸等各種植被類型。建群種主要為暗針葉林如岷江冷杉（Abies faxoniana）和紫果云杉（Picea balfouriana）為主的；除喬木外，林下及林窗有細(xì)枝茶 藨 子四川忍冬（Loniceras zechuanica）、多個(gè)種杜鵑花（Rhododendron spp.）和柳屬幾個(gè)種（Salix spp.）等灌木植物在其中零星分布。草甸植被類型為莎草類+禾草類+雙子葉雜草類群系，莎草類主要以線葉嵩草（Kobresia capillifolia）為主；禾草類植物主要有冷地早熟禾（Poa poophagorum）和草地早熟禾（Poa pratensis）等；雙子葉雜草類植物中常見的有毛茛科的鈍裂銀蓮花（Anemone obtusiloba）、條葉銀蓮花（Anemone trullifolia）等。

按海拔自下而上可分為3條分界線：ATE下沿，ATE中部，ATE上沿。高山樹線交錯(cuò)帶由從ATE下沿到ATE上沿之間的整個(gè)過渡區(qū)構(gòu)成。

于2018年11月上旬在研究區(qū)域內(nèi)選擇具有代表性的典型針葉林-灌叢-草甸交錯(cuò)帶，此時(shí)高寒氣候特征明顯且尚無雪被覆蓋。調(diào)查訪問不同海拔的植被類型等基本概況。采用平行樣帶法收集土壤層樣品，平行于等高線從低海拔至高海拔依次經(jīng)針葉林上沿（海拔（3 900±50）m）、杜鵑灌叢（海拔（4 080±60）m）和草甸（海拔（4 200±50）m）分別設(shè)置一條寬20 m的平行樣帶。在每一植被類型的平行樣帶內(nèi)設(shè)置3個(gè)樣方作為重復(fù)，樣方面積為20 m×20 m。在每個(gè)樣方上按蛇形采樣法選取10～15個(gè)土壤采樣點(diǎn)，將0～20 cm土樣用鐵鏟小心鏟出并混勻成1個(gè)土樣，小心剔除石礫、根系及其他雜質(zhì)后裝入無菌牛皮袋中作為一個(gè)土壤樣本。土壤經(jīng)冷藏運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室后風(fēng)干，過2 mm篩后盡快分析。各研究點(diǎn)地理特征和植被情況詳情見表1。

表1 高寒土壤樣品采集位點(diǎn)地理特征和植被群落類型Table 1 Geographical characteristics and vegetation community types of alpine soil sample collection sites

1.2 土壤氮組分分級及樣品測定

分別采用物理和化學(xué)試劑連續(xù)提取方法對土壤進(jìn)行不同氮組分分級和測定[18]。物理分級將不同粒級土壤分開，每個(gè)化學(xué)分級步驟提取1個(gè)氮組分并測定相應(yīng)組分含量。

物理分級：利用超聲波分散后將過篩后的ATE土壤樣品采用濕篩法分離成不同的粒級。f1表示被篩分成0.25～2 mm的組分，f2表示0.05～0.25 mm的組分，f3表示 0.02～0.05 mm 的組分，f4為＜0.02 mm粒級的土壤組分。粒徑＞0.05 mm的土壤顆粒中的有機(jī)氮被定義為PON[6]，＜0.02 mm的土壤被用于進(jìn)行化學(xué)分級提取各級礦物結(jié)合態(tài)氮組分[18]。

化學(xué)分級：提取容器均采用塑料容器，每步驟提取均加入65 mL提取液，必要時(shí)調(diào)節(jié)pH。第一次震蕩浸提16 h，第二次震蕩浸提1 h，轉(zhuǎn)速160 r/min；分離采用3 300 g加速度離心15 min；

①稱取2 g粒徑小于0.02 mm的f4粒級土壤組分放入燒杯，加入超純水200 mL和飽和KAl（SO4）2溶液3 mL并靜止2 d待其沉淀，取上清液，剩下部分再次離心后取上清液，2次得到的上清液混合得組分N1。沉淀為礦物結(jié)合態(tài)有機(jī)質(zhì)。

②在上步二次離心后所得的沉淀中加入0.5 mol/L的K2SO430 mL，震蕩浸提后離心，取出上清液，余下部分加入40 mL K2SO4，震蕩浸提后離心，再次取上清液經(jīng)混合后得組分N2。

③在上步二次離心所得的沉淀中加入0.1 mol/L，pH=9.7的40 mL Na2B4O7，震蕩浸提離心后取出上清液，剩下部分加入浸提液后再次離心后取上清液，再次取上清液經(jīng)混合后得組分N3。

④在上步二次離心所得的沉淀中加入pH=10.2的0.1 mol/L 40 mL Na2P2O7，取離心后上清液，剩下部分加入浸提液后再次離心后取上清液，再次取上清液經(jīng)混合后得組分N4。

⑤在上步二次離心所得的沉淀中加入0.1 mol/L40 mL的NaOH，震蕩浸提離心后取出上清液，余下部分加入40 mL上述提取液再次震蕩浸提離心，將2次取出的上清液混合，得組分N5。

⑥在上步二次離心所得的沉淀中加入5 mL 0.33 mol/L冷H2SO4酸化處理10 min至pH=1.5，再加入40 mL 0.1 mol/LNaOH溶液，取出離心后上清液，余下部分加入40 mL 0.1 mol/L NaOH后再次震蕩浸提離心，取上清液。將兩次提取后的上清液混合，得組分N6。

⑦在上步二次離心所得的沉淀中加入pH=8的0.1 mol/L 20 mL Na2S2O4溶液處理靜置10 min，再次加入0.1 mol/L 20 mL的NaOH溶液，震蕩浸提離心后取出上清液，余下部分再次加入40 mL 0.1 mol/L NaOH溶液后取離心上清液，將2次取得的上清液混合，得到組分N7。在沉淀中加入40 mL超純水浸提1h后離心，除去離心后上清液，洗去殘存的Na2S2O4。

⑧在上一步洗去殘存Na2S2O4的沉淀中加入20mL 8 mol/L的HF靜置處理10 min，加入20 mL 0.1 mol/L NaOH震蕩浸提，取離心后的上清液，余下的沉淀再次加入40 mL 0.1 mol/L的NaOH經(jīng)過震蕩浸提離心后將上清液取出，將2次離心得到的上清液經(jīng)混合后用0.1 mol/L NaOH中和，得到組分N8。剩下的沉淀再次加入40 mL超純水震蕩浸提1 h后離心去掉上清液，去除殘留HF。

⑨余下不溶組分，為組分N9，穩(wěn)定性很強(qiáng)的胡敏素（腐殖質(zhì)）氮。

上述提取液中的氮含量采用TOC/TN分析儀（型號(hào)Milti N/C 2100S，德國Jena）分析測定；最后的不溶組分樣品中的氮含量采用元素分析儀（型號(hào)Vario EL/micro cube，德國 elementar）分析測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因子方差分析（ANOVA）和鄧肯式多重比較（Duncans multiple test）用于不同海拔下土壤氮素含量的差異顯著性檢驗(yàn)（P=0.05）；

2 結(jié)果與分析

2.1 高山樹線交錯(cuò)帶土壤粒級分布特征及有機(jī)氮含量

由圖1可以看出，對于同一海拔高度不同粒級，土壤質(zhì)量百分比隨粒級減小顯著降低。f3和f4粒級顆粒物的質(zhì)量占比很低，而f1和f2的質(zhì)量占比則顯著高于f3及f4粒級的土壤，f1粒級土壤質(zhì)量略高于f2粒級土壤的占比，f3粒級土壤質(zhì)量略高于f4粒級土壤質(zhì)量占比。

對比不同海拔高度同一粒級土壤質(zhì)量的百分比，f1粒級土壤質(zhì)量百分比的趨勢表現(xiàn)為ATE下沿＞ATE上沿＞ATE中部；f2及f3粒級土壤質(zhì)量百分比的總體趨勢表現(xiàn)相近，ATE中部＞ATE上沿＞ATE下沿；f4粒級土壤質(zhì)量百分比的在各海拔梯度上無顯著差異。

圖1 高山樹線交錯(cuò)帶不同粒級土壤質(zhì)量百分比及有機(jī)氮含量Figure 1 Percentage by weight and organic nitrogen content of soil with different grain sizes in alpine treeline ecotone

在所有粒級中，土壤含氮量均很高，其中在樹線上沿f2粒級土壤最高，含氮量達(dá)到了9.663 g/kg；ATE下沿f4粒級的土壤最低，含氮量為3.107 g/kg。f1和f2粒級顯著高于f3和f4粒級土壤氮含量。

對比同一海拔不同粒級，氮含量均表現(xiàn)為f2＞f1＞f3＞f4，除ATE下沿外，f2相較于f1降低幅度不大，f3相較于f2下降顯著，f4相較于f3下降也比較顯著。ATE上沿和ATE中部土壤氮含量隨粒級變化影響顯著，而ATE下沿土壤氮含量相對比較穩(wěn)定。對比同一粒級不同海拔土壤氮含量變化趨勢總體表現(xiàn)為隨著海拔的升高而升高。對于f1和f2粒級土壤，ATE下沿氮含量與ATE中部和ATE上沿差異顯著，ATE上沿和ATE中部氮含量差異不顯著。對于f3和f4粒級土壤，氮含量隨海拔升高而升高顯著升高。

2.2 高山樹線交錯(cuò)帶土壤氮化學(xué)分級特征

從圖2可以看出，高山樹線交錯(cuò)帶上土壤氮組分的含量最高不超過1%，表明礦物結(jié)合態(tài)氮的含量在土壤中的含量極低。除N1，N3，N4和N6組分氮含量在海拔梯度上無顯著性差異之外，其他組分氮的含量在海拔梯度上都呈現(xiàn)顯著性差異。氮組分主要以NF3、NF5、NF9的形式存在，而活性相對較高的N1和N2含量卻很低，僅占總提取氮組分的4.76%。對于N3，N5和N7組分，不同組分氮含量表現(xiàn)出相同的變化趨勢隨著海拔的升高而升高；對于N1，N2，N6和N8組分，氮含量隨海拔上升先升高后降低。對于N4和N9組分，N4組分表現(xiàn)為ATE下沿＞ATE上沿＞ATE中部，N9組分表現(xiàn)為ATE上沿＞ATE中部＞ATE下沿。

圖2 高山樹線交錯(cuò)帶土壤礦物結(jié)合態(tài)氮組分含量Figure 2 Content of mineral-associated nitrogen components in the alpine treeline ecotone

2.3 高山樹線交錯(cuò)帶土壤氮的穩(wěn)定性

在連續(xù)提取礦物結(jié)合態(tài)氮組分過程中，穩(wěn)定性越高的組分越難提取。PON相比于MAON活性更高，POM所占的比例越大說明該土壤氮活性越高[19]；在礦物結(jié)合態(tài)氮中組分N1～N9的穩(wěn)定性依次升高。

由表2可知，對于川西ATE區(qū)域海拔梯度土壤有機(jī)氮，PON占比極大，均占到了94%以上，遠(yuǎn)高于其他生態(tài)系統(tǒng)PON比例[20-21]。其中粒徑0.25～2.00 mm的有機(jī)氮含量占比在ATE下沿處顯著高于ATE上沿和中部，粒徑0.05～0.25 mm及0.02～0.05 mm有機(jī)氮含量則顯著低于ATE上沿和中部。粒徑＜0.02 mm的有機(jī)氮含量和MAON占比均極低，在海拔梯度上差異不顯著。

表2 各組分氮含量在總有機(jī)氮中的占比Table 2 Proportion of organic nitrogen in total organic nitrogen %

由表3可知，其中穩(wěn)定性最高的組分N9的占比最高，占總提取氮20.7%～28.71%，占比最大的位置為ATE下沿，達(dá)到了28.71%；活性最高的組分水溶性有機(jī)氮N1和可溶性有機(jī)氮N2的占比很低，N1占礦物結(jié)合態(tài)氮中的 3.72%～4.55%，N2占1.80%～2.55%，隨海拔升高而下降，表現(xiàn)為ATE下沿＞ATE中部＞ATE上沿；雖然MAON中活性最低的胡敏素氮N9含量很高，但N1～N9占總有機(jī)氮的比例均極低。

表3 各化學(xué)分級氮組分含量在礦物結(jié)合態(tài)氮中的占比Table 3 Proportion of nitrogen content for mineral-associated nitrogen with different chemical grades %

3 討論

森林土壤有機(jī)氮庫在參與生物地球化學(xué)循環(huán)和反饋全球氣候變化中起著十分重要的作用。ATE作為承受環(huán)境變化壓力最大的高寒生態(tài)系統(tǒng)之一，揭示青藏高原東緣川西ATE表層土壤有機(jī)氮特征有助于認(rèn)識(shí)青藏高原高寒區(qū)域土壤氮循環(huán)過程[22]。本研究利用物理-化學(xué)聯(lián)合分離方法將不同活性的氮組分盡可能分離開來，以此來量化不同組分氮含量。相較于僅研究總氮儲(chǔ)量而言，更有利于進(jìn)一步探究氣候變化對土壤氮過程的影響機(jī)制。

PON被認(rèn)為是土壤中氮的“活性”來源，與MAON，它們更容易被分解者獲取[20]，對氮的礦化和周轉(zhuǎn)有顯著的貢獻(xiàn)。由劉志祥等研究顯示，在溫帶土壤中PON含量約占土壤總氮的50%左右[6]。本研究表明，ATE土壤顆粒組成主要是以粗顆粒形式存在，有機(jī)氮存在形式以活性高的PON為主，占總有機(jī)氮的94%以上，MAON占比不足2%，比例遠(yuǎn)低于一般土壤[18]。MAON中各化學(xué)分級組分在海拔梯度上差異均不顯著，表明MAON對環(huán)境變化響應(yīng)較弱?！癿icrobial filter”假說指出，容易分解的高質(zhì)量凋落物優(yōu)先被微生物同化，微生物同化物隨后被礦物表面所吸收進(jìn)而形成MAON，而含有更多結(jié)構(gòu)木質(zhì)素成分的低質(zhì)量凋落葉中的氮在土壤中作為PON積累[23]，川西高寒土壤地被物質(zhì)量低，微生物活性低時(shí)造成氮素以PON為主，MAON含量占比極低的主要原因[23-24]。

海拔高度顯著影響ATE土壤有機(jī)氮含量。PON在ATE下沿處顯著高于ATE上沿和中部。川西高原由于陡峭的海拔梯度，在短距離內(nèi)具有不同的森林類型和微氣候。研究表明，森林群落結(jié)構(gòu)和水熱因子是驅(qū)動(dòng)森林氮變化的主要原因[9，11，25]。ATE 下沿針葉凋落物質(zhì)量低，土壤含水量低，使得PON不易轉(zhuǎn)化為水溶性氮而在總有機(jī)氮中以相較于ATE上沿和中部占比更高[9]。與PON不同，MAON含量及各化學(xué)分級氮組分比例在海拔梯度上差異不顯著，說明MAON對于氣候變化的響應(yīng)具有一定的穩(wěn)定性。

在MAON中活性最高的水溶性和可溶性有機(jī)氮含量占比最低，可能是因?yàn)榛钚缘M分主要存在于PON中。除胡敏素氮外，分別用Na2B4O7、Na4P2O7和NaOH提取的礦物弱固持有機(jī)氮、陽離子固持有機(jī)氮和強(qiáng)連接有機(jī)氮的含量占比最大，與S.Prieto等的研究結(jié)果類似[26]。其中弱固持有機(jī)氮含量最高，表明MAON以弱離子結(jié)合為主，容易礦化。強(qiáng)連接有機(jī)氮含量顯著低于ATE上沿和中部，可能是因?yàn)锳TE下沿氮素主要集中在胡敏素中。M.Gocke等[27]研究發(fā)現(xiàn)，碳酸鹽涂層覆蓋在土壤團(tuán)聚體上，對土壤有一定的保護(hù)作用。其主要存在于石灰土壤中，因此在川西高寒土壤中碳酸鹽閉蓄有機(jī)氮含量較低。鐵氧化物氮隨海拔升高顯著升高，S.Turner等[28]研究表明鐵氧化物的含量主要受pH的影響。HF溶液可以破壞土壤中的硅酸鹽，硅酸鹽中可能包含著之前無法被提取的強(qiáng)固持有機(jī)氮[29]。在HF提取后的溶液中，強(qiáng)固持有機(jī)氮含量均較低且在海拔梯度上表現(xiàn)出顯著差異，這主要與海拔高度導(dǎo)致的硅酸鹽含量差異有關(guān)[18]。ATE中部胡敏素氮在MAON中所占的比例顯著低于ATE上沿和下沿，ATE中部地被物較ATE下沿少且比ATE上沿受到的低溫限制弱，導(dǎo)致穩(wěn)定性氮積累較少，在MAON中占比低[28]。但胡敏素氮在總有機(jī)氮中占比僅為0.27%～0.41%，表明腐殖化并非川西高海拔土壤主要氮過程。

4 結(jié)論

ATE物理分級土壤有機(jī)氮主要集中在不穩(wěn)定的粗顆粒土壤中（≥0.05 mm），存在形式主要為PON，占總有機(jī)氮的94.08%以上，顯示川西土壤有機(jī)氮庫活性高。粒級為0.05～0.25 mm的土壤有機(jī)氮含量最高，粒級＜0.02 mm的土壤最低。隨著海拔升高土壤有機(jī)氮含量顯著增加。MAON占比不足總有機(jī)氮的1.47%，土壤MAON的主要存在形式是以礦物弱固持有機(jī)氮、陽離子固持有機(jī)氮、強(qiáng)連接有機(jī)氮及胡敏素氮為主。除可溶性有機(jī)氮、陽離子固持有機(jī)氮以及土壤礦物強(qiáng)固持有機(jī)氮，其余礦物結(jié)合態(tài)氮組分在MAON中的占比對海拔梯度變化均無顯著響應(yīng)，所有礦物結(jié)合態(tài)氮組分在總有機(jī)氮中占比均不受海拔梯度顯著影響。胡敏素氮占總有機(jī)氮比例極低，顯示高寒土壤因氮庫活性高而受海拔梯度影響顯著，礦物結(jié)合及腐殖化均非高寒土壤主要過程。受全球變化的影響，隨著海拔降低（氣溫升高），ATE土壤氮的礦化速率將加快，土壤不穩(wěn)定性組分降低，有機(jī)氮總量下降，穩(wěn)定性上升。