唐昱婷，湯加勇，趙 華

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所/動(dòng)物抗病營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 611130）

集約化的養(yǎng)殖模式、環(huán)境及飼料中的病原體、有害物質(zhì)等都給現(xiàn)代化規(guī)模養(yǎng)殖帶來(lái)挑戰(zhàn)，在這種條件下，如何提高動(dòng)物免疫力和抗病力顯得尤為重要。維持腸道健康是提高動(dòng)物免疫力和抗病力的重要途徑之一。

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）屬乳桿菌屬，是產(chǎn)L-乳酸，不產(chǎn)芽孢，厭氧耐酸的革蘭氏陽(yáng)性共生菌，被用于生產(chǎn)酸奶，也是臨床實(shí)驗(yàn)中研究最多的益生菌之一。LGG能通過(guò)抑制病原體黏附和定植平衡腸道菌群，維護(hù)腸道屏障完整性，調(diào)節(jié)腸道免疫功能等方式促進(jìn)腸道健康，并且具有預(yù)防和治療腹瀉、排除毒素、提高動(dòng)物生產(chǎn)的能力。本文主要綜述LGG對(duì)腸道屏障功能的影響及可能機(jī)制研究進(jìn)展，以期為益生菌產(chǎn)品發(fā)揮生理功能及畜牧養(yǎng)殖替抗提供理論基礎(chǔ)和新的思路。

1 LGG對(duì)腸道屏障功能的影響及可能機(jī)制

腸道屏障是抵御入侵腸道有害微生物和抗原的第一道防線[1]，是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要屏障。任何一部分缺陷或受損都可能導(dǎo)致腸通透性增加、腸菌群失調(diào)，導(dǎo)致腸道炎癥以及其他腸道疾病，嚴(yán)重影響畜禽腸道健康。LGG對(duì)腸道的保護(hù)作用主要體現(xiàn)在以下3個(gè)方面：平衡腸道菌群；維護(hù)腸道屏障結(jié)構(gòu)完整；調(diào)節(jié)腸道免疫功能、增強(qiáng)腸道免疫力。

1.1 平衡腸道菌群

健康腸道中微生物保持著一定平衡，以此形成對(duì)抗病原體的重要保護(hù)屏障。LGG因耐酸（pH 1.8～3.2）[2]和膽鹽（1%w/v）[3]能以活菌形式進(jìn)入腸道，通過(guò)其強(qiáng)黏附能力、分泌有機(jī)酸等抑菌物質(zhì)的方式抑制病原菌黏附和定植在腸上皮細(xì)胞，平衡腸道菌群，維護(hù)腸道健康。

黏附能力強(qiáng)是LGG的一個(gè)顯著特點(diǎn)[3-4]。LGG對(duì)腸黏膜和黏液的黏附力主要得益于其自身結(jié)構(gòu)中的胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）[5]、菌毛 SpaCBA[6]、菌毛基因簇 spaDEF[7]、表層蛋白（surface layer protein，SLP）[8]及分泌的黏附蛋白 LGG-0816[9]協(xié)同作用，有利于LGG與病原微生物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合腸細(xì)胞，刺激免疫系統(tǒng)，抑制病原菌的黏附和致病作用，平衡腸道菌群。彭富強(qiáng)等[10]研究發(fā)現(xiàn)，添加1010CFU/kg和1011CFU/kg LGG能顯著降低21日齡肉雞盲腸內(nèi)容物中大腸桿菌菌落數(shù)，效果與添加抗生素組（抗菌肽鋅40 mg/kg）相似，且有優(yōu)于抗生素組的趨勢(shì)。W.Panpetch等[11]用LGG處理膿毒癥小鼠后減少了糞便中沙門氏菌數(shù)量，減輕了腸道泄漏。Lin R.等[12]用109CFU/day LGG和嗜酸乳桿菌補(bǔ)充劑處理暴露于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（doxynivalenol，DON）的無(wú)胸腺裸鼠，通過(guò)增加阿克曼菌、恢復(fù)擬桿菌豐度平衡腸道菌群，并與對(duì)照組菌群無(wú)顯著差異，同時(shí)促進(jìn)有機(jī)酸（主要是丁酸）產(chǎn)生防止腸道受損。益生菌在低齡或是免疫能力低下動(dòng)物中的益生效果仍不能確定，以上試驗(yàn)顯示出LGG對(duì)免疫缺陷的無(wú)胸腺裸鼠也可能維持腸道健康，這一發(fā)現(xiàn)有利于今后為低齡或免疫能力低下動(dòng)物的腸道保護(hù)提供理論依據(jù)及可能性。

1.2 維持腸道屏障結(jié)構(gòu)完整

腸道屏障功能的行使主要建立在完整的腸上皮細(xì)胞和細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)。LGG能通過(guò)刺激腸上皮細(xì)胞，促進(jìn)緊密連接、黏蛋白等表達(dá)，維護(hù)腸道屏障結(jié)構(gòu)完整，有效阻止細(xì)菌及內(nèi)毒素等有害物質(zhì)較強(qiáng)的刺激和正常菌群侵襲；此外，研究者發(fā)現(xiàn)的一種LGG外分泌蛋白p40能通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）介導(dǎo)調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase）/蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）信號(hào)途徑，防止細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖，并能對(duì)右旋糖酐硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）、惡唑酮（oxazolone）、三硝基苯磺酸（trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS）等造成的腸道損傷進(jìn)行修復(fù)，維護(hù)腸道屏障完整性。

1.2.1 LGG通過(guò)促進(jìn)緊密連接和黏蛋白表達(dá)維護(hù)腸道屏障結(jié)構(gòu)完整

LGG能通過(guò)促進(jìn)緊密連接和黏蛋白表達(dá)維護(hù)腸道屏障的完整性。ZO-1起到連接細(xì)胞的作用，對(duì)維持緊密連接結(jié)構(gòu)具有重要作用。E.Miyauchi等[13]用4種乳桿菌（105CFU/well）對(duì)人上皮Caco-2細(xì)胞進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LGG通過(guò)增加ZO-1表達(dá)水平，顯著恢復(fù)人上皮Caco-2細(xì)胞跨上皮電阻（trans-epithelial resistance，TER），從而穩(wěn)定緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)和分布，減輕腫瘤壞死因子（TNF-α）誘導(dǎo)的細(xì)胞損壞程度，維護(hù)腸上皮屏障完整性。Mao J.D.等[14]用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)仔豬腸道屏障受損引發(fā)腹瀉時(shí)發(fā)現(xiàn)2.5×1010CFU/g LGG可以通過(guò)緩解ZO-1、claudin3表達(dá)降低，恢復(fù)回腸絨毛高度降低，緩解仔豬腹瀉。黏蛋白2（mucoprotein-2，MUC2）是產(chǎn)生黏液層的關(guān)鍵[15]，LGG能促進(jìn)腸道表達(dá)黏蛋白，抑制病原微生物黏附及細(xì)菌易位。A.F.Mattar等[16]研究發(fā)現(xiàn)，向單層腸上皮Caco-2細(xì)胞表面添加104～108CFU/mL LGG能顯著增加MUC2表達(dá)，抑制病原微生物的黏附和細(xì)菌易位，當(dāng)LGG濃度達(dá)到108CFU/mL時(shí)能100%抑制細(xì)菌易位。黏液素能介導(dǎo)細(xì)菌的生長(zhǎng)，LGG刺激黏蛋白的生成可能也有助于LGG的定植。

1.2.2 LGG通過(guò)分泌蛋白p40促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖

LGG還能通過(guò)調(diào)節(jié)腸細(xì)胞凋亡維護(hù)和修復(fù)腸道，這一功能的實(shí)現(xiàn)依賴于LGG分泌的蛋白p40和p75，其中p40起主要作用。PI3K/Akt信號(hào)途徑在調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及遷移中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)失活幾種促凋亡途徑，包括Bad、Caspase9和Caspase3及通過(guò)激活細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子，如cyclin/cyclin-依賴性激酶（CDK），起到抗凋亡作用。研究發(fā)現(xiàn)，p40發(fā)揮作用主要是通過(guò)激活去整合素-金屬蛋白酶17（a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）使表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）磷酸化激活PI3K/Akt信號(hào)通路[17-19]，抑制細(xì)胞因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[20]，上調(diào)腸上皮細(xì)胞黏蛋白產(chǎn)生，維護(hù)腸道屏障完整性，增強(qiáng)腸道屏障保護(hù)作用。p40是第一個(gè)通過(guò)特定信號(hào)通路促進(jìn)腸上皮穩(wěn)態(tài)的益生菌蛋白，能明顯減少細(xì)胞因子引起的腸上皮損傷，失去了p40的LGG上清液不能預(yù)防TNF誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞受損。除LGG外還有一部分乳酸桿菌也能通過(guò)外分泌蛋白形式非接觸性地對(duì)腸上皮細(xì)胞顯示出抗凋亡和促增殖作用，但某些乳酸桿菌如嗜酸乳桿菌必須與腸上皮細(xì)胞接觸發(fā)揮作用。這為益生菌的應(yīng)用難點(diǎn)提供了新思路。目前，對(duì)這種外分泌蛋白的研究主要集中在細(xì)胞水平，在動(dòng)物上的研究及應(yīng)用還需進(jìn)一步深入。

1.3 調(diào)節(jié)腸道免疫功能

LGG能刺激腸道相關(guān)淋巴組織（gut-associated lymphoid tissue，GALT）誘發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生免疫效應(yīng)因子，發(fā)揮免疫作用，抵抗病原微生物對(duì)機(jī)體的侵襲；同時(shí)，LGG及其有效組分（SLP、EPS）通過(guò)Toll樣受體介導(dǎo)調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)腸道細(xì)胞因子進(jìn)行調(diào)節(jié)，提高機(jī)體對(duì)外來(lái)微生物入侵和疾病的防治。

1.3.1 LGG能增強(qiáng)免疫力

IgA能利用其高親和力中和微生物毒素和病原體，并防止共生細(xì)菌利用低親和力破壞黏膜表面，以非炎癥方式實(shí)現(xiàn)免疫保護(hù)和免疫排斥，是重要的先天防御方式，能促進(jìn)腸道長(zhǎng)期穩(wěn)態(tài)[21-22]。LGG能通過(guò)促進(jìn)IgA產(chǎn)生對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有效保護(hù)。Yan F.等[23]通過(guò)構(gòu)建早期LGG定植模型發(fā)現(xiàn)新生小鼠出生后1～5 d口服LGG能促進(jìn)其生長(zhǎng)、腸上皮細(xì)胞增殖、分化及緊密連接的形成，同時(shí)越早開(kāi)始口服其腸道中LGG定植率越高，最高可達(dá)70%～100%，LGG定植有利于顯著提高幼齡及成年小鼠IgA產(chǎn)生，并顯著降低 DSS誘導(dǎo)的TNF、KC、IL-6 mRNA表達(dá)升高，減輕腸道泄漏，增加糞便中乳酸桿菌的數(shù)量，對(duì)小鼠腸道產(chǎn)生長(zhǎng)久保護(hù)作用。此外，p40對(duì)腸道免疫也顯示出正面效應(yīng)：p40通過(guò)激活EGFR介導(dǎo)上調(diào)小鼠腸上皮細(xì)胞增殖誘導(dǎo)配體April基因表達(dá)，促進(jìn)小鼠腸道固有層B細(xì)胞產(chǎn)生IgA，調(diào)節(jié)黏膜免疫防止炎癥，預(yù)防和改善小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎[24-25]，同時(shí)p40上調(diào)了B細(xì)胞激活因子（Baff）的表達(dá)，這也可能有利于IgA產(chǎn)生。此外，研究者發(fā)現(xiàn)結(jié)腸上皮細(xì)胞分泌胞外囊泡中的熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）能增強(qiáng)LGG產(chǎn)生p40，并增強(qiáng)LGG介導(dǎo)的腸道炎癥改善[26]，這揭示了LGG的抗炎作用也能被腸上皮細(xì)胞反向增強(qiáng)，從而維持腸道健康。這一發(fā)現(xiàn)為開(kāi)發(fā)益生菌的衍生蛋白作為新的治療劑提供了理論基礎(chǔ)和新思路。

1.3.2 LGG能減輕腸道炎癥

NF-κB、MAPK和ERK信號(hào)通路是動(dòng)物體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)通路，他們的激活與炎癥發(fā)生、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)。LGG及其有效組分（SLP、EPS）能通過(guò)Toll樣受體介導(dǎo)調(diào)節(jié) NF-κB、MAPK、ERK 信號(hào)通路，調(diào)節(jié)外來(lái)抗原誘發(fā)的炎癥反應(yīng)。

LGG能通過(guò)特異性激活天然免疫Toll樣受體9（toll-like receptors 9，TLR9），減弱壞死性小腸結(jié)腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）的發(fā)展[27]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LGG還依賴TLR2/TLR9抑制脂多糖受體TLR4 的信號(hào)傳導(dǎo)[28-29]，抑制 p65/NF-kB、p38/MAPK和ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)促炎因子IL-6、IL-12和TNF-α表達(dá)，減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥[30-31]。LGG的某些成分對(duì)機(jī)體免疫功能也有影響。Gao K.等[32]發(fā)現(xiàn)LGG 的表層蛋白（SLP）、胞外多糖（EPS）也能抑制p65/NF-kB、p38/MAPK和ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，下調(diào)促炎因子IL-6、IL-12、TNF-α的表達(dá)，減輕腸道炎癥。而同為組分之一的CpG-寡核苷酸（CpG-ODN）顯示出相反的結(jié)果，可能是CpG-ODN和LPS對(duì)小腸上皮細(xì)胞（intestinal epithelial cells，IECs）具有協(xié)同免疫刺激作用，CpG-ODN能特異性識(shí)別TLR9[33]，激活TLR9后完成下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并誘導(dǎo)強(qiáng)烈的Th1型炎癥反應(yīng)，這也為益生菌及宿主間的相互分子作用機(jī)制提供了新思路。

以上研究表明，LGG能通過(guò)識(shí)別、調(diào)節(jié)天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)，提高抗炎因子、降低促炎因子含量提高機(jī)體對(duì)外來(lái)微生物入侵和疾病的防治。其保護(hù)腸道的可能機(jī)制為：LGG能促進(jìn)丁酸等有機(jī)酸的產(chǎn)生，平衡腸道菌群；LGG能通過(guò)分泌蛋白p40激活PI3K/Akt信號(hào)途徑促進(jìn)緊密連接及黏蛋白的表達(dá)，保護(hù)腸道物理和化學(xué)屏障、預(yù)防腸細(xì)胞受損；LGG及其有效成分SLP、EPS能通過(guò)抑制TLR4的激活，抑制p65/NF-κB、p38/MAPK以及ERK1/2信號(hào)途徑，抑制LPS誘導(dǎo)的炎性因子升高，緩解腸道炎癥，同時(shí)促進(jìn)IgA增強(qiáng)腸道免疫力（圖1）。

圖1 LGG對(duì)腸道屏障作用機(jī)制圖Figure 1 The mechanism of action of LGG on intestinal barrier

2 LGG在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用

LGG在近40年時(shí)間內(nèi)，由于其優(yōu)良的益生特性被廣泛研究和應(yīng)用到動(dòng)物生產(chǎn)中。

2.1 提高生產(chǎn)性能

LGG能提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能。Chen F.等[34]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加2×108CFU/g LGG能顯著降低特定無(wú)病原體雞（specific pathogen-free，SPF）腸道中大腸桿菌數(shù)量，提高其平均日增重（ADG），降低料肉比（FCR），改善生產(chǎn)性能。Zhang L.Y.等[35]研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加1010CFU/d LGG懸浮液飼喂6周能顯著增加犢牛的平均日增重。M.Sewaka等[36]用10g/kg洋姜和108CFU/g LGG飼喂紅羅非魚(yú)時(shí)發(fā)現(xiàn)，添加益生菌后具有更高的（P＜0.05）飼料轉(zhuǎn)化率（FCR）、比生長(zhǎng)速率（SGR）和平均日增重（ADG），促進(jìn)了紅羅非魚(yú)的生長(zhǎng)。

2.2 預(yù)防和減輕腹瀉

LGG能有效預(yù)防及減輕病原微生物誘發(fā)的腹瀉。Mao X.B.等[30]在飼料中添加109CFU/kg LGG可以一定程度緩解輪狀病毒（rotavirus，RV）誘導(dǎo)的斷奶仔豬腹瀉。焦連國(guó)等[37]按照1 kg/1 000 kg飼料比例添加LGG凍干粉（1010CFU/g）連續(xù)飼喂斷奶仔豬3周，提高了仔豬終末重及飼料轉(zhuǎn)化率，降低腹瀉發(fā)病率。Zhang L.等[38]在飼糧中添加 1.2×108CFU/g LGG 能抑制大腸桿菌引起的IL-6、IL-1β和TNF-α升高，減輕炎癥，保護(hù)腸道健康，顯著降低斷奶仔豬腹瀉率。研究表明，LGG能顯著降低感染沙門氏菌小鼠的 TNF-α、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO），維持IL-10水平，比另一種植物乳桿菌ZS2058對(duì)腸道炎癥有更強(qiáng)的緩解作用[39]。這提示LGG通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物來(lái)增強(qiáng)腸道抗體防御以及調(diào)節(jié)機(jī)體炎性細(xì)胞因子有效減輕動(dòng)物腹瀉。

2.3 其他作用

LGG除了具有上述益生作用外，還具有增強(qiáng)腸道抗氧化、減少飼料中有害物質(zhì)、維護(hù)腸道微生態(tài)平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用。LGG能顯著降低酒精損傷小鼠的氧化應(yīng)激并恢復(fù)腸道菌群，保護(hù)酒精性肝損傷及腸道氧化應(yīng)激和炎癥[40]；顯著降低氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)，提高超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性，減輕Caco-2細(xì)胞的氧化應(yīng)激[41]。飼料中的有害物質(zhì)如黃曲霉毒素[42]、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇[12]、常見(jiàn)鐮刀菌毒素[31]、重金屬鎘、鉛[43]以及微囊藻毒素-LR[44]等會(huì)進(jìn)入腸道，而LGG可以通過(guò)輕微降解毒素及吸附、固定減少毒素轉(zhuǎn)運(yùn)等方式保護(hù)腸道和動(dòng)物健康[44-46]。LGG能促進(jìn)分泌有機(jī)酸、細(xì)菌素等抑菌物質(zhì)，抑制有害菌的定植，平衡菌群，維護(hù)腸道微生態(tài)平衡[12，47]。此外，LGG能增強(qiáng)機(jī)體免疫力以保護(hù)動(dòng)物健康，LGG能增加IgA、IgG和IgM的表達(dá)，降低IL-6、IL-1β的表達(dá)，減輕TNF-α和TNF-γ誘導(dǎo)的屏障功能障礙、防止病原體或促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)的對(duì)腸道結(jié)構(gòu)和功能的有害影響[48]。

3 小結(jié)

LGG作為一種模式益生菌對(duì)動(dòng)物腸道健康展現(xiàn)出多方面的保護(hù)作用，除了能增強(qiáng)腸道物理、化學(xué)屏障功能外，還能調(diào)節(jié)腸道微生物和免疫功能，促進(jìn)損傷腸道修復(fù)等，在動(dòng)物生產(chǎn)應(yīng)用上也得到良好效果。除p40外，LGG的另一種分泌蛋白p75的具體作用機(jī)制尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。目前對(duì)益菌蛋白p40、p75及有效成分SLP、EPS的研究主要集中在細(xì)胞水平，在動(dòng)物上的應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。LGG在實(shí)際生產(chǎn)中的最佳菌株、使用劑量、使用時(shí)間等還有待深入研究?？傊琇GG在動(dòng)物生產(chǎn)中所展現(xiàn)出的良好效果，尤其當(dāng)動(dòng)物受到有害物質(zhì)刺激時(shí)起的保護(hù)作用，表明LGG未來(lái)能作為一種良好的替抗微生態(tài)制劑應(yīng)用在畜牧養(yǎng)殖上。