秦歡 ，張兵 ，馬喆 ，張瀛 ，張鈺坤 ，劉志東

（1.天津中醫(yī)藥大學組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥發(fā)現(xiàn)與制劑技術教育部工程研究中心，天津 301617；3.徐州工程學院食品與生物工程學院，徐州 221008）

乳腺癌已成為全球女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴重影響了女性的身心健康[1-3]。臨床治療以手術為主，輔助以放化療、內分泌治療、靶向治療等手段[4]。紫草素（SKN）及其衍生物有抗炎[5]、抗病毒[6]、抗免疫[7]等多種功效，通過降低 PI3K、Akt的表達及其磷酸化水平[8-9]，抑制細胞活力，上調乳腺癌MCF-7細胞中凋亡相關蛋白半胱氨酸蛋白酶（Caspase）-3和Caspase-9的表達，破壞細胞的凋亡調節(jié)平衡，促進MCF-7細胞發(fā)生自噬[10-12]，影響腫瘤血管異常增生等多種途徑來共同發(fā)揮抗腫瘤作用[13]。由于SKN不溶于水，體內吸收存在巨大阻礙，限制了其進一步的開發(fā)利用。因此通過制劑學手段提高靶細胞/部位的藥物攝取及聚集尤為重要。納米結構脂質載體（NLC）因膜材中加入了不相容的液體脂質，使納米?？梢砸越Y晶缺陷型或無定型結構存在[14]，增加了藥物的包封率和載藥率，存儲更加穩(wěn)定，可實現(xiàn)多途徑給藥，解決了難溶性藥物的給藥困境[15]。本研究依據(jù)NLC優(yōu)勢，制備了紫草素納米脂質載體（SKN-NLC），能夠顯著提高SKN的溶解度，通過聚乙二醇（PEG）修飾來延長藥物在體內的循環(huán)時間，從而提高SKN的生物利用度，更好地發(fā)揮抗腫瘤效果。SKN化學結構式見圖1。

圖1 SKN化學結構式

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC 20AT型高效液相色譜儀（島津公司，日本）；RET BS 25型磁力攪拌器（艾卡公司，德國）；X射線衍射儀（布魯克公司，德國）；SorvallST 16R型臺式通用冷凍離心機（賽默飛世爾科技公司，美國）；Nano ZS型激光散射粒徑分析儀（馬爾文公司，英國）；TECNAI 10透射電子顯微鏡（飛利浦公司，荷蘭）；DSC-204差示掃描量熱儀（耐馳公司，德國）；FORMA 3111 CO2恒溫培養(yǎng)箱（賽默飛世爾科技公司，美國）；生物安全柜（賽默飛世爾科技公司，美國）；Spark型多功能酶標儀（帝肯公司，瑞士）；GE In Cell Analyzer 2000高內涵細胞成像分析系統(tǒng)（通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)有限公司，中國）；KQ-400KDE型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，中國）；FA 124型萬分之一天平（天津億諾科學技術有限公司，中國）；XP205電子天平（梅特勒托利多公司，瑞士）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（默克密理博公司，美國）。

1.2 藥品與試劑 SKN對照品（成都普斯生物科技股份有限公司，批號：82854-37-3，含量>98%）；人乳腺癌細胞MCF-7細胞（中國科學院細胞庫）；0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸（EDTA）（賽默飛世爾科技公司，批號：25200-056）；雙抗（10 000 U 青霉素+10 000 μg鏈霉素，賽默飛世爾科技公司，批號：15140-122）；DMEM基礎培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技公司，批號：2044490）；胎牛血清（上海逍鵬生物，批號：04-001-1ACS）；香豆素-6（伊諾凱科技有限公司，批號：S2137139，含量>98%）；Hoechst33342（赫希斯特公司，批號：B8040）；CCK-8試劑盒（同仁化學研究所）；黑色96孔板（德國葛來娜公司，批號：655090）；96孔板（無錫耐思生物科技股份有限公司，批號：701001-1）；細胞培養(yǎng)瓶（無錫耐思生物科技股份有限公司，批號：707003）；辛酸癸酸三酰甘油（Miglyol812，北京鳳禮精求商貿有限責任公司）；大豆磷脂（上海艾偉拓醫(yī)藥科技有限公司，批號：SY-SI-180101）；聚氧乙烯硬脂酸酯（西格瑪公司，批號：MKBV6365V）；山崳酸甘油酯（嘉法獅公司，批號：108833）；三氯甲烷（CHCl3，天津康科德科技有限公司，分析純，批號：20181101）；無水乙醇（天津市康科德科技有限公司，色譜純）；超濾離心管（規(guī)格50 kDa，默克密理博公司）；乙腈（賽默飛世爾科技公司，色譜純）；甲酸（化成工業(yè)株式會社，分析純）；甲醇（賽默飛世爾科技公司，色譜純）；二甲基亞砜（DMSO，西格瑪公司，批號：D2650）；0.22μm注射器式微孔濾膜（Millex-GP，默克密理博公司）；去離子水（自制）。

2 方法與結果

2.1 SKN-NLC的制備 采用乳化-固化法制備NLC，將處方量的山崳酸甘油酯、液體脂質辛酸/癸酸三甘油酯溶于CHCl3中，卵磷脂溶于無水乙醇中，在74～75℃水浴中混合均勻構成油相；將處方量的聚氧乙烯硬脂酸酯溶于去離子水中構成水相，將油相注入水相中，磁力攪拌均勻至澄清，過0.22 μm有機濾膜后置于4℃條件下冷藏固化，即得NLC。同法可制得SKN-NLC和SKN-PEG-NLC。

2.2 含量測定方法

2.2.1 色譜條件色譜柱：Agilent ZorbaxSB-C18（安捷倫公司，美國，4.6 mm×50 mm，5 μm，批號：B11055，S.N.USFA003181）；流動相：乙腈-0.2%甲酸水（75∶25）；檢測波長：516 nm；流速：1 mL/min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定SKN對照品4.90mg，加甲醇定容至10mL，得到濃度為0.49mg/mL的對照品儲備液。

2.2.3 標準曲線的制備 取對照品儲備液，分別稀釋出 245.00、122.50、61.25、30.63、15.31、7.66 μg/mL的溶液，每次進樣10 μL，以濃度為橫坐標，峰響應值為縱坐標，繪制標準曲線。得到線性回歸方程為：Y=10 523X-8 748.9，r2=0.999 9（n=3），結果表明 SKN在7.66～245.00 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.4 專屬性考察 分別取SKN對照品溶液、乙腈破乳后的Blank-NLC溶液、SKN-NLC溶液、SKNPEG-NLC溶液，每次進樣10μL，記錄色譜圖。如圖2所示，輔料和溶劑對藥物測定沒有干擾，表明該方法專屬性良好。

圖2 SKN專屬性考察結果

2.2.5 精密度實驗 取“2.2.2”項中的對照品儲備液，分別以甲醇稀釋配制成低（30.63 μg/mL）、中（61.25 μg/mL）、高（122.50 μg/mL）3 個濃度的溶液，按照“2.2.1”項下的色譜條件，1 d內重復進樣3次，計算日內精密度（n=3）。連續(xù)測定3 d，計算日間精密度。計算得日內RSD分別為0.48%、0.63%、0.90%；日間RSD分別為1.24%、0.76%、1.08%，表明日內、日間精密度較好。

2.2.6 穩(wěn)定性實驗 精密量取SKN-NLC，在0、12、24 h時分別吸取10 μL進樣，按照“2.2.1”項下的色譜條件，測定峰面積，計算峰面積的RSD（n=6）。結果RSD為2.63%，表明樣品在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復性實驗 平行制備6份破乳的SKNNLC樣品，按“2.2.1”項下色譜條件測定，測得SKN的平均含量為 28.53 μg/mL，RSD 為 1.03%（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.8 包封率的測定 按“2.1”項下方法制備SKNNLC樣品溶液，取0.3 mL樣品加去離子水稀釋至3 mL，取2 mL稀釋后的溶液置于50 KDa超濾離心管內管中，5 000 r/min，離心半徑9 cm，離心20 min，取外管中液體，按照“2.2.1”項下的色譜條件進行SKN含量測定，游離SKN含量記為W游離。從上述SKN-NLC樣品溶液中取0.2 mL，加入1.8 mL乙腈超聲破乳，5 000 r/min，離心半徑9 cm，離心20 min。按照“2.2.1”項下的色譜條件進行SKN含量測定，處方中SKN總含量記為W總。按照下列公式計算包封率，包封率（%）=[（W總-W游離）÷W總]×100%。其中W游離為超濾離心管外管中藥物量，W總為加入藥物和脂質材料總量。測得SKN-NLC和SKN-PEG-NLC的包封率分別為95%和98%。

2.3 NLC的理化表征

2.3.1 粒徑電位測定 取制備的SKN-NLC和SKN-PEG-NLC適量，用去離子水稀釋至適宜濃度，室溫下用激光粒徑測定儀分別測定樣品的粒徑和Zeta電位。測定3次，取平均值。結果顯示，SKNNLC 粒徑為（17.69±2.32）nm，多分散指數(shù)（PDI）為（0.61±1.41）；Zeta 電位為 [-（8.81±1.39）]mV。SKNPEG-NLC 粒徑為（19.68±1.25）nm，PDI為（0.28±0.68）；Zeta電位為[-（20.27±1.27）]mV。見開放科學（資源服務）標識碼（OSID）。

2.3.2 制劑形態(tài)觀察 取Blank-NLC、SKN-NLC、SKN-PEG-NLC溶液稀釋至適宜濃度，滴加在覆蓋銅網(wǎng)的碳膜上，使液滴在銅網(wǎng)上呈半球形液面，待自然干燥后，滴入2%磷鎢酸溶液染色制片，復染3min，用濾紙沿銅網(wǎng)周圍吸干染液，自然干燥后置于透射電子顯微鏡（TEM）下觀察NLC形態(tài)并拍照。

各組制劑外觀形態(tài)見OSID，較為澄清透明，質地均一，空白制劑有淡藍色乳光。由圖3可知，透射電鏡下制劑溶液呈圓形小球狀，分散均勻，形狀規(guī)整，大小在20 nm左右。與納米激光粒徑儀測定的結果相吻合。

圖3 NLC的透射電鏡結果

2.4 差示掃描量熱測定 精密稱取SKN對照品、Blank-NLC凍干粉、SKN-NLC凍干粉、SKN-PEGNLC凍干粉、物理混合物各5mg，升溫速率為10℃/min，掃描范圍為30～300℃，氮氣流速為30 mL/min，差示掃描量熱曲線結果見圖4。

圖4 NLC的差示掃描量熱結果

結果顯示，SKN和物理混合物在150℃下顯示出SKN的放熱特征峰。在200℃有1個明顯吸熱特征峰，而該峰在Blank-NLC、SKN-NLC和SKNPEG-NLC 中消失。Blank-NLC、SKN-NLC、SKNPEG-NLC和物理混合物在50、180和225℃下顯示出3個明顯的放熱峰，而SKN中并未出現(xiàn)，表明SKN以非晶體形態(tài)包裹于NLC中。

2.5 X射線衍射研究 精密稱取SKN對照品、Blank-NLC凍干粉、SKN-NLC凍干粉、SKN-PEGNLC凍干粉和物理混合物約50 mg，選用Cu靶/石墨單色器，設定檢測條件：電壓40 kV，電流200 mA，掃描范圍 5°～80°，掃描速度 5°/min，采樣時間 1 s，用X射線衍射儀進行測定，結果見圖5。

圖5 NLC的X射線衍射結果

SKN 和物理混合物在 7.5°、10.0°、14.5°時表現(xiàn)出明顯的SKN峰值，而在Blank-NLC、SKN-NLC和SKN-PEG-NLC中該峰值消失。Blank-NLC、SKNNLC、SKN-PEG-NLC 和物理混合物在 20°～25°范圍內顯示出NLC的特征峰。結果表明SKN以分子分散形式而不是游離形式存在于NLC中，這與差示掃描量熱測定的結果一致。

2.6 體外細胞攝取研究

2.6.1 細胞培養(yǎng) 使用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，于37℃下外接5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MCF-7細胞，無菌培養(yǎng)與傳代。

2.6.2 SKN的細胞毒性評價 以每孔8 000個細胞的密度將MCF-7細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%細胞密度后，分別使用濃度為0、1、2、4、5、8、10、15、30μmol/L的SKN溶液處理，采用CCK-8法在450nm下測定細胞活性，計算細胞存活率。得SKN半數(shù)抑制濃度（IC50）為 11.05 μmol/L，且細胞的存活率隨著SKN給藥濃度的增大而降低，具有濃度依賴性。細胞存活率（%）=[（As-Ab）÷（Ac-Ab）]×100%（As為實驗孔吸光度，Ab為空白孔吸光度，Ac為對照孔吸光度）。

2.6.3 載體抗腫瘤細胞增殖評價 按“2.6.2”項實驗步驟，分別加入 100 μL 濃度為 4、11、15 μmol/L的SKN、SKN-NLC和SKN-PEG-NLC溶液，計算細胞存活率。采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較時，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett-t法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

SKN在4 μmol/L時各組對MCF-7細胞均無明顯毒性，與對照組比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。當濃度為11 μmol/L時，SKN-PEG-NLC溶液抗腫瘤效果與SKN溶液組及SKN-NLC溶液組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.001）。當濃度為15μmol/L時，SKN-PEG-NLC溶液抗腫瘤效果與SKN溶液組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。見圖6。

圖6 NLC 的細胞毒性結果（±s，n=6）

2.6.4 NLC細胞攝取評價 按“2.6.2”項實驗步驟培養(yǎng)MCF-7細胞，避光操作每孔加入1 μg/mL的Hoechst 33342溶液孵育30 min，用常溫的磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗細胞2遍。加入稀釋好的香豆素-6標記的各組制劑，共孵育4 h。將處理好的96孔板放入細胞高內涵成像儀中，設定染料的激發(fā)波長與發(fā)射波長進行測定。統(tǒng)計分析方法同“2.6.3”項。

熒光主要分布在細胞核周圍，即SKN-NLC被MCF-7細胞攝取后主要存在于細胞質中。制劑組細胞熒光強度明顯高于SKN溶液組，表明MCF-7細胞對SKN-NLC的攝取高于溶液組。此外，SKNPEG-NLC溶液的熒光強度高于SKN-NLC溶液組，推測PEG修飾后可增加MCF-7細胞對SKN-NLC的攝取。綜上，通過將SKN包載于NLC中，表面進行PEG修飾后可增加MCF-7細胞對制劑的攝取。見圖7。

圖7 高內涵熒光強度柱狀圖（A）和高內涵熒光強度（B）細胞攝取結果（±s，n=6）

3 討論

本研究通過乳化蒸發(fā)-低溫固化法制備了SKN-NLC，通過透射電鏡和馬爾文激光粒徑分析儀可知，制劑外觀圓整，粒徑分布均勻，體系穩(wěn)定。粒徑分布和電位是納米載體質量評價的一個非常重要的指標[16]，本研究以實驗室前期考察得到的最佳處方制備出的SKN-NLC粒徑為17.69 nm，SKNPEG-NLC粒徑為19.68 nm。相較于 SKN-NLC，SKN-PEG-NLC的PDI更小，體系更均一，包封率更高。這種空間穩(wěn)定材料有望制備出更為理想的SKN-NLC制劑，為體內外SKN遞送提供穩(wěn)定保障[17]。本研究通過差示掃描量熱儀對SKN、Blank-NLC、SKN-NLC、SKN-PEG-NLC及物理混合物的吸熱峰進行表征研究和比較分析，證明了SKN在NLC中以無定形形式存在，X射線衍射實驗也證明了上述結論。由細胞增殖抑制實驗可知SKN-PEG-NLC的腫瘤抑制作用大于SKN-NLC和SKN溶液。本研究中選擇脂溶性的香豆素-6作為熒光探針來替代SKN制備熒光標記的NLC，通過考察發(fā)現(xiàn)香豆素-6濃度為 0.05 μg/mL，Hoechst濃度為 1 μg/mL 時對MCF-7細胞無毒性作用，可以進行后續(xù)的細胞攝取實驗。本實驗綜合以上研究結果，通過制備NLC提高了SKN的生物利用度，并初步證明了PEG化的SKN-NLC在體外抑制乳腺癌的優(yōu)勢作用，但SKN進入細胞后的抑瘤機制等仍需進一步研究。