李承浩，鄭富香，游廣嬌，任曉亮，鄧雁如

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617）

多糖又稱多聚糖，是由糖苷鍵連接起來的醛糖或酮糖組成的高聚物，分子量為數(shù)萬至數(shù)百萬，用通式（C6H10O5）n表示[1-3]。多糖不僅在生物體生命活動中起著重要的營養(yǎng)作用，而且還在維持生物體的生命活動中發(fā)揮著重要生理功能，因此其與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸一起被視為生物體中最重要的4種大分子物質(zhì)[4-6]。

多糖是一種很好的佐劑，不僅可以作為一種能量物質(zhì)和結(jié)構(gòu)成分，還有一部分多糖可以參與細(xì)胞的代謝及生理調(diào)節(jié)。近年來，關(guān)于活性多糖生物功能的報道主要包括多糖的抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、降血脂、抗病毒、提高免疫功能等，如牛膝多糖為水溶性的小分子多糖，具有調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)肝臟、抑制腫瘤作用；如桑黃多糖具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、治療肝炎、抗炎、抗氧化、降血糖等生理活性。除了作為藥物用于治療，中藥多糖在皮膚領(lǐng)域也具有延緩衰老、美白、曬后修復(fù)、祛痘抗炎、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合等功效，可以作為功效化妝品活性成分的天然來源，還可以作為凝固劑、潤滑劑、增稠劑、絮凝劑、懸浮劑、凝膠劑、添加劑等廣泛應(yīng)用于化工、食品、石油、紡織印染、水處理和醫(yī)藥等行業(yè)。

中藥多糖主要來源于植物、藻類和微生物類。其中植物類多糖種類最為繁多，且沒有細(xì)胞毒性，應(yīng)用于生物體毒副作用小，所以在醫(yī)藥和保健品行業(yè)得到了更好的推廣及應(yīng)用[7-8]。本文選用17種市面常售多糖研究其多糖含量與蛋白質(zhì)含量、吸濕性、黏度、抗氧化活性，希望總結(jié)出多糖的共性，為以后的多糖應(yīng)用提供依據(jù)[9-10]。

1 材料

1.1 藥品與試劑 黃芪多糖，批號：SJH17102201，購自西安四季生物科技有限公司；蟲草多糖，批號：CC20170625，購自蘭州百禾生物科技有限公司；大棗多糖，購自西安通澤生物科技有限公司；枸杞多糖，批號：20170725，購自西安通澤生物科技有限公司；白樺茸多糖，批號：TZ170810，購自西安通澤生物科技有限公司；灰樹花多糖，批號：2017091204，購自西安萬方生物科技有限公司；白術(shù)多糖，批號：BZ20170715，購自蘭州百禾生物科技有限公司；刺五加多糖，批號：GN170606-SG，購自寧波金艾農(nóng)生物科技有限公司；土茯苓多糖，購自陜西森弗天然制品有限公司；甘草多糖，批號：GCDT170714，購自陜西森弗天然制品有限公司；黃精多糖，購自西安美川生物科技有限公司；桑黃多糖，購自西安萬方生物科技有限公司；黨參多糖，購自西安維珍生物科技有限公司；豬苓多糖，批號：Virgin170301，購自西安維珍生物科技有限公司；海帶多糖，批號：CY170901，購自陜西慈源生物技術(shù)有限公司；蒲公英多糖，批號：CY170807，購自陜西慈源生物技術(shù)有限公司；牛膝多糖，批號：QZ17-7-26，購自西安青芷生物技術(shù)有限公司；苯酚，分析純，購自西隴科學(xué)股份有限公司；濃硫酸，分析純，購自開封開化有限公司試劑廠；無水葡萄糖，批號：160824，純度≥98%，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；蒸餾水，購自屈臣氏食品飲料有限公司；考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，購自北京索萊寶科技有限公司；維生素C，批號：171204，純度≥98%，購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；FeCl3·6H2O，分析純，購自上海麥克林生化科技有限公司；FeSO4·7H2O，分析純，購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備 旋轉(zhuǎn)黏度計（NDJ-79，上海平軒科學(xué)儀器有限公司）；臺式高速離心機（TG16-WS，長沙湘儀離心機儀器有限公司）；十萬分之一天平（Sartorius BT125D，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；pH計（PB-10，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；萬分之一天平（FA2004A，上海精天電子儀器有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥（WC-20，天津市中藥機械廠）；溫濕計時表（WS-A6，上海天宇科技儀表有限公司）；智能磁力加熱攪拌器（SZCL-4B，鞏義市予華儀器有限公司）；紫外可見分光光度計（TU-1901，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-S8，金壇盛藍(lán)儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 中藥多糖的含量測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 精密稱定105℃干燥至恒質(zhì)量的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品2.00 mg于10 mL棕色容量瓶內(nèi)，加蒸餾水稀釋至刻度，得到0.2 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.5、1.2、1.5 mL 于 10 mL 具塞試管中，補水至2.0 mL，加入1 mL 5%苯酚溶液后迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，室溫放置5 min，置沸水浴中加熱15 min，取出冰水浴5 min，冷卻至室溫，于490 nm波長處測定吸光度，以空白試劑為參照測定吸光度。

以對照品濃度X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度Y（ΔAbs）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 Y=12.421X+0.206 1（r=0.999 5），表明葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.005～0.15 mg/mL線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度實驗 精密稱取葡萄糖對照品溶液，連續(xù)測定6次，RSD為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性實驗 精密稱取白術(shù)多糖粉末0.2 g定容至100 mL容量瓶，從中精密量取2 mL于具塞試管中，平行6份，然后加入5%苯酚1 mL、濃硫酸5 mL，靜置 5 min，水浴 15 min，冰浴 5 min，放置室溫后測定其吸光度。RSD為2.20%，表明重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實驗 取“2.1.3”項下配制好的溶液，每隔10 min測定1次吸光度，RSD為0.98%，表明樣品在1 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率實驗 精密吸取白術(shù)多糖樣品溶液6份，每份2 mL，分別精密加入一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，按上述方法操作測定吸光度，計算得到加樣回收率為98.06%，RSD為2.39%，符合方法學(xué)要求。

2.1.6 多糖含量測定 分別精密稱定多糖粉末2 g于100 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻至溶解完全，4 000 r/min離心15 min（離心半徑為10 cm），取上清，即得多糖溶液。精密量取適量多糖溶液，加蒸餾水稀釋得到0.02 mg/mL的供試品溶液。精密吸取供試品溶液2.0 mL，按照“2.1.1”項下自“加入1 mL 5%苯酚溶液”起依法操作，平行6份。根據(jù)回歸方程及公式計算市售多糖樣品的多糖含量。樣品中多糖含量（%）＝cdvm×1 000。其中，c為樣品待測液中葡萄糖的質(zhì)量濃度（mg/mL），d為待測液的稀釋倍數(shù)，v為待測液的總體積（mL），m為稱取的樣品質(zhì)量（g）。根據(jù)回歸方程及公式計算得到17種市售多糖含量均較高[11-14]。

2.2 蛋白質(zhì)含量測定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 考馬斯亮藍(lán)試劑配置：稱取100 mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50 mL 95%的乙醇及加入100 mL 85%的磷酸，加蒸餾水稀釋至1 L，最終溶液含0.01%的考馬斯亮G-250、4.7%的乙醇及8.5%的磷酸，置于棕色試劑瓶中備用，4℃保存。蛋白標(biāo)準(zhǔn)液配置：精密稱取牛血清白蛋白10mg置于10 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度即得1.0 mg/mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃儲存（用后放入冰箱）。分別精密量取1.0 mg/mL的牛血清白蛋白溶液 0.01、0.06、0.08、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mL于10 mL具塞試管中，加水補足至1 mL，得到梯度濃度對照品溶液，向試管中加入考馬斯亮藍(lán)試劑5.0 mL混勻，室溫放置10 min，用紫外可見分光光度計測定其于595 nm下的吸光度，以蒸餾水為空白對照，以牛血清白蛋白溶液X（mg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度Y（△Abs）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為 Y=4.597X+0.093（r=0.999 0），線性范圍為0.01～0.3 mg/mL。

2.2.2 精密度實驗 精密量取濃度為0.06 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液1 mL，加入考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑5.0 mL混勻，室溫放置10 min后于595 nm測定吸光度，連續(xù)測定6次。RSD為0.40%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性實驗 精密稱取500 mg灰樹花多糖樣品，稀釋50倍得到濃度為10 mg/mL的樣品溶液，從中量取1 mL，平行6份，按上述方法操作測定吸光度。RSD為2.22%，表明穩(wěn)定性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實驗 精密量取10 mg/mL的灰樹花多糖樣品溶液1 mL，按上述方法操作，每隔10 min測定吸光度，RSD為2.0%，1 h內(nèi)其線性范圍良好。

2.2.5 加樣回收率實驗 取10 mg/mL的灰樹花多糖樣品溶液0.5 mL，加入濃度為0.4 mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250顯色試劑，混勻，室溫放置10 min，于595 nm處測定吸光度，以0號試管為空白對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出相應(yīng)濃度，計算加入蛋白質(zhì)量，并計算回收率，分別進(jìn)行6次平行測定。RSD為2.98%，提示線性范圍良好。

2.2.6 蛋白質(zhì)含量測定 精密稱定各多糖樣品粉末0.1 g于10 mL棕色容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，搖勻至完全溶解，得到濃度為10 mg/mL的多糖溶液。精密量取多糖溶液1 mL，按照本實驗“2.2.1”項下自“向試管中加入考馬斯亮藍(lán)試劑5.0 mL”起依法操作，平行測定3次，并根據(jù)回歸方程計算多糖粉末中蛋白質(zhì)含量[15-18]。

2.3 多糖吸濕性測定 在已恒質(zhì)量的稱量瓶底部分別加入1.5 g干燥多糖粉末，置玻璃干燥容器內(nèi)備用；將底部含有氯化鈉過飽和溶液的玻璃干燥器放入25℃烘箱中恒溫24 h，此時干燥器內(nèi)的相對濕度為50%；將多糖粉末置于有氯化鈉過飽和溶液的干燥箱中，于25℃恒溫箱中保存，定時取樣稱取質(zhì)量，重復(fù)3次，計算吸濕百分率。經(jīng)觀察，發(fā)現(xiàn)所有的多糖粉末隨著時間的延長均呈現(xiàn)出不同程度的吸濕效果[19-22]。吸濕百分率=（吸濕后質(zhì)量-吸濕前質(zhì)量）/吸濕前質(zhì)量×100%。

2.4 多糖黏度測定

2.4.1 多糖溶液濃度對黏度的影響 將多糖溶液配置成 0.02、0.05、0.10、0.15 g/mL 不同濃度的多糖溶液，室溫下磁力攪拌充分溶解，在剪切速率750 r/min條件下測定其黏度3次，取平均值。

2.4.2 溫度對多糖溶液黏度的影響 配置濃度為0.15 g/mL的多糖溶液，在剪切速率為750 r/min條件下，將多糖溶液分別在25、45、65、85℃攪拌，測定其黏度變化[23-24]。

2.5 總抗氧化能力測定

2.5.1 溶液制備 FRAP試劑：1）300 mmol/L，pH=3.6的醋酸鈉緩沖溶液：稱取無水醋酸鈉0.187 1 g，加入冰醋酸1.6 mL，加蒸餾水至100 mL。采用pH計測定其pH為3.6。2）10 mmol/L TPTZ（溶解在40 mmol/L鹽酸溶液中）：精確量取濃鹽酸（36%～38%）0.333 mL，用水定容至100 mL容量瓶內(nèi)，得到40 mmol/L鹽酸溶液。精確稱取TPTZ粉末31.23 mg于10 mL棕色容量瓶內(nèi)，用40 mmol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，得到10 mmol/L TPTZ溶液澄清透明。3）20 mmol/L FeCl3：精確稱取 FeCl3·6H2O 固體粉末54.06 mg于10 mL棕色容量瓶內(nèi)，加蒸餾水稀釋至刻度，得到20 mmol/L FeCl3溶液。將醋酸鈉緩沖溶液（300 mmol/L，pH=3.6）、TPTZ（10 mmol/L）和 FeCl3（20 mmol/L）以體積比 10∶1∶1 比例混合，配成 FRAP試劑（臨用前新鮮配制）[25]。

對照品溶液：精密稱取27.8 mg FeSO4·7H2O顆粒于10 mL棕色容量瓶內(nèi)，加入蒸餾水稀釋至刻度，得到10 mmol/L的FeSO4溶液。精密量取FeSO4溶液適量，加水逐級稀釋，分別得到濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2 mmol/L 的對照品溶液。

樣品溶液：精密稱取多糖粉末25 g于50 mL棕色容量瓶內(nèi)，加水稀釋至刻度，混勻，水浴加熱至溶解完全，放至室溫，4 000 r/min離心15 min（離心半徑為10 cm），取上清得到多糖溶液。分別精密量取適量中藥多糖溶液，加蒸餾水稀釋，得到5種不同濃度樣品溶液。

陽性對照溶液：另精密稱定維生素C對照品2 mg于10 mL棕色容量瓶內(nèi)，加水稀釋至刻度，混勻，得到濃度為0.2 mg/mL的維生素C溶液。取維生素C溶液適量，逐級稀釋，得到6種不同濃度維生素C溶液。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 分別精密量取0.2 mL不同濃度的對照品溶液于10 mL具塞試管內(nèi)，迅速加入6mL孵育的FRAP試劑，于37℃下水浴放置30min，取出測定相應(yīng)的吸光度值，檢測波長為595 nm。以蒸餾水為空白對照。以FeSO4溶液的濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)X，吸光度為縱坐標(biāo)Y（△Abs），繪制FeSO4溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行回歸分析。所得方程為Y=0.710 8X-0.007 1，相關(guān)系數(shù)r為0.999 8，線性范圍為0.1～5.0 mmol/L。

2.5.3 樣品測定 分別精密量取0.2 mL各濃度樣品溶液及維生素C溶液于5 mL具塞試管內(nèi)，按照本實驗“2.5.2”項下“迅速加入6 mL孵育的FRAP試劑”依法操作，測定吸光度。FRAP值是以1mmol/L FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，通過FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，達(dá)到相同吸光度值所需FeSO4量，此值即為樣品的FRAP值。以各樣品溶液、維生素C溶液的FRAP值為縱坐標(biāo)Y，溶液濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)X，繪制各樣品總抗氧化能力圖[26-29]。

3 實驗結(jié)果

3.1 17 種多糖的理化性質(zhì)分析 市售的17種中藥多糖粉末中多糖含量、蛋白質(zhì)含量如表1所示，其中多糖含量較高，蛋白質(zhì)含量較少，其中黨參多糖中多糖含量最高，枸杞多糖中多糖含量最低。

表1 17種多糖含量、蛋白質(zhì)含量數(shù)據(jù)%

多糖的吸濕性測定結(jié)果如圖1所示，結(jié)果表明17種多糖均具有較好的吸濕性，其中刺五加多糖的吸濕性最低，枸杞多糖的吸濕性最高。如圖2所示，多糖黏度隨溶液濃度升高而增強，可能是由于多糖濃度升高，多糖鏈之間的相互作用加強，導(dǎo)致多糖分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使多糖溶液黏度變大?？疾鞙囟葘Χ嗵侨芤吼ざ鹊挠绊?，結(jié)果如圖3所示，多糖黏度隨溫度的升高而降低，這是由于溫度升高導(dǎo)致多糖分解，生成了小分子的糖，使自身黏度下降[30-32]。

圖1 多糖吸濕曲線圖

圖2 多糖黏度與濃度關(guān)系圖

圖3 多糖黏度與溫度關(guān)系圖

3.2 抗氧化能力測定結(jié)果 應(yīng)用鐵離子（Fe3+）還原法測定多糖的體外抗氧化活性，當(dāng)Y值為1時所測得的X值為多糖對Fe3+還原能力濃度，可知每種多糖均具有抗氧化能力。其中刺五加多糖的抗氧化能力最強，黃精多糖抗氧化能力最弱。將17種多糖與維生素C對Fe3+還原能力的對比可知，17種中藥多糖對Fe3+均具有還原能力，但其抗氧化活性低于維生素C。見表2。

表2 17種中藥多糖與維生素C的總抗氧化能力

4 討論與結(jié)論

以往對中藥有效成分的研究通常集中在小分子物質(zhì)，多見生物堿、萜類、黃酮、揮發(fā)油及苷類等小分子化合物，而蛋白質(zhì)、多糖、多肽等生物大分子物質(zhì)相對較少。而實際上，生物大分子也是中藥重要的有效成分，由于受到研究技術(shù)和方法的限制，且生物大分子本身的分離、純化和結(jié)構(gòu)測定難度較大，導(dǎo)致鮮有研究。

本實驗首先采用苯酚-硫酸法測定17種中藥多糖粉末中多糖含量，通過黏度計、紫外可見分光光度法等方法研究各多糖的黏度、吸濕性、蛋白含量等基本理化性質(zhì)。研究結(jié)果表明，市售的17種中藥多糖粉末中多糖含量均較高，且蛋白質(zhì)含量非常低。多糖的吸濕性測定結(jié)果表明，多糖具有較好的吸濕性。多糖黏度測定結(jié)果表明，多糖黏度隨溶液濃度升高而增大，可能是因為增大多糖濃度，使多糖鏈之間的相互作用加強，導(dǎo)致多糖分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而使多糖溶液黏度變大。多糖黏度隨溫度升高而降低，這是由于溫度升高，導(dǎo)致多糖分解，生成了小分子的糖，使多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，從而黏度下降。應(yīng)用鐵離子還原法測定多糖的體外抗氧化活性，將17種多糖與維生素C對Fe3+還原能力的比較可知，17種中藥多糖對Fe3+的還原能力較弱，其中刺五加多糖在17種多糖中抗氧化能力最強，但也僅為維生素C的1/43。本文總結(jié)了17種多糖的理化性質(zhì)，希望可以對日后多糖的研究提供理論性支持。