徐曉雪

（首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100069）

流式細(xì)胞術(shù)是利用流體聚焦原理，高速檢測(cè)流體中單個(gè)細(xì)胞或微顆粒多種熒光標(biāo)記參數(shù)的技術(shù)，具有高速、定量、單細(xì)胞多參數(shù)的特點(diǎn)，常用來(lái)分析血液細(xì)胞、培養(yǎng)細(xì)胞等復(fù)雜細(xì)胞群體中多種細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)差異，可以幫助醫(yī)學(xué)工作者了解細(xì)胞的分化、增殖和功能狀態(tài)[1]。隨著流式細(xì)胞儀的發(fā)展和標(biāo)記熒光的豐富，流式檢測(cè)可以同時(shí)檢測(cè)的指標(biāo)不斷增多，流式多參數(shù)檢測(cè)使檢測(cè)數(shù)據(jù)的信息量成倍增加，不同檢測(cè)指標(biāo)可以互相印證，數(shù)據(jù)可靠度大幅提升。同時(shí)還可以節(jié)省實(shí)驗(yàn)樣品和試劑，減少樣品制備步驟、大大提高流式實(shí)驗(yàn)的效率，成為流式技術(shù)的重要發(fā)展方向，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。目前，已經(jīng)出現(xiàn)了超過(guò)20～30 色的流式分析方案，多參數(shù)流式技術(shù)是醫(yī)學(xué)科研與臨床中重要的單細(xì)胞分析技術(shù)之一[2]。但是，多參數(shù)流式技術(shù)檢測(cè)影響因素復(fù)雜，各項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)調(diào)節(jié)范圍大，操作主觀性強(qiáng)，常規(guī)簡(jiǎn)單分析的手動(dòng)調(diào)節(jié)方式無(wú)法滿足檢測(cè)要求，需要更加客觀科學(xué)的設(shè)定檢測(cè)參數(shù)才能獲得理想的結(jié)果?；诖?，本文以FACSymphony 流式細(xì)胞儀檢測(cè)九色標(biāo)記人外周血實(shí)驗(yàn)為例，詳細(xì)介紹在多參數(shù)流式儀上客觀分析多色樣品的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料 多種熒光標(biāo)記CD4 抗體參考品試劑盒，BV480 標(biāo)記CD3 抗體，BUV395 標(biāo)記CD4 抗體，PERCPCY5.5 標(biāo)記CD8 抗體，PECY7 標(biāo)記CD25抗體，BV711 標(biāo)記CD27 抗體，BB515 標(biāo)記CD45RA抗 體，APC-R700標(biāo)記CD56抗體，AF647標(biāo)記CD127 抗體，BV786CD197 抗體，溶血素，染色緩沖液，洗滌緩沖液，流式染色緩沖液，CST 質(zhì)控微球（以上試劑購(gòu)自美國(guó)BD 公司）。材料：人靜脈血5 ml，采自健康志愿者。

1.2 主要儀器 BD FACSymphony 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD 公司），臺(tái)式冷凍離心機(jī)Allegra X-15R（美國(guó)貝克曼公司）。

1.3 樣品制備

1.3.1 人外周血全血細(xì)胞表面抗體標(biāo)記九色樣品制備取200μl 全血，加入推薦用量的BV480 標(biāo)記CD3抗體，BUV395標(biāo)記CD4抗體，PERCPCY5.5標(biāo)記CD8 抗體，PECY7 標(biāo)記CD25 抗體，BV711 標(biāo)記CD27抗體，BB515 標(biāo)記CD45RA 抗體，APC-R700 標(biāo)記CD56 抗體，AF647 標(biāo)記CD127 抗體，BV786CD197抗體和染色緩沖液，室溫避光孵育30 min，加入5 ml溶血素，室溫溶血10 min，離心洗滌300 g，5 min，2次，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl。

1.3.2 九色單陽(yáng)樣品與空白對(duì)照制備 每個(gè)單陽(yáng)樣品管加入200 μl 全血，分別加入推薦用量的BV480標(biāo)記CD3 抗體，BUV395 標(biāo)記CD4 抗體，PERCPCY5.5 標(biāo)記CD8 抗體，PECY7 標(biāo)記CD25 抗體，BV711 標(biāo)記CD27 抗體，BB515 標(biāo)記CD45RA 抗體，APC-R700 標(biāo)記CD56 抗體，AF647 標(biāo)記CD127 抗體，BV786CD197 抗體和染色緩沖液，室溫避光孵育，溶血素，離心洗滌同上，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl。另取200 μl 全血樣品，不加入熒光抗體，僅溶血素，離心洗滌同上，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl，作為空白樣品。

1.3.3 人外周血全血細(xì)胞九色CD4 單標(biāo)樣品制備每個(gè)單陽(yáng)樣品管加入200 μl 全血，分別加入與檢測(cè)樣品相同熒光素標(biāo)記的參考品試劑盒中的CD4 抗體，即BV480 標(biāo)記CD4 抗體，BUV395 標(biāo)記CD4 抗體，PERCPCY5.5 標(biāo)記CD4 抗體，PECY7 標(biāo)記CD4抗體，BV711 標(biāo)記CD4 抗體，BB515 標(biāo)記CD4 抗體，APC-R700 標(biāo)記CD4 抗體，AF647 標(biāo)記CD4 抗體，BV786CD4 抗體和染色緩沖液，均采用推薦用量，室溫避光孵育，溶血素，離心洗滌同上，加入洗滌緩沖液重懸至500 μl。

1.4 儀器校準(zhǔn) 儀器保持維護(hù)良好狀態(tài)下運(yùn)行CST質(zhì)控追蹤程序，校準(zhǔn)儀器基本參數(shù)穩(wěn)定。

1.5 儀器最佳檢測(cè)器電壓確定 逐個(gè)分析各色標(biāo)記CD4 單陽(yáng)樣品，目標(biāo)檢測(cè)器參數(shù)從300 開(kāi)始，每次遞增30，直到600 或者檢測(cè)信號(hào)接近檢測(cè)器上限停止，讀取各樣品陰性、陽(yáng)性群體熒光中位數(shù)值，計(jì)算各檢測(cè)通道的信噪比，以信噪比最高的檢測(cè)器電壓值做為本通道最佳檢測(cè)電壓。

1.6 根據(jù)染色樣品確定最佳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)電壓 在初步檢測(cè)參數(shù)下運(yùn)行9 色樣品，檢查各通道信號(hào)強(qiáng)弱是否適合，對(duì)于熒光強(qiáng)度超出檢測(cè)范圍的通道要下調(diào)檢測(cè)電壓保證信號(hào)位于檢測(cè)器的線性采集窗口內(nèi)，調(diào)整后確定為最佳檢測(cè)參數(shù)，完成九色樣品采樣。

1.7 CD4 單陽(yáng)計(jì)算補(bǔ)償參數(shù) 建立儀器自動(dòng)補(bǔ)償程序，分別獲取陰性對(duì)照樣品和九個(gè)CD4 單標(biāo)樣品，準(zhǔn)確選取淋巴細(xì)胞群和各CD4 單陽(yáng)群，運(yùn)行補(bǔ)償計(jì)算程序，計(jì)算并保存補(bǔ)償參數(shù)。

1.8 九色單陽(yáng)對(duì)照驗(yàn)證補(bǔ)償參數(shù) 將補(bǔ)償參數(shù)賦值給之前獲取的9 色樣品數(shù)據(jù)，在新補(bǔ)償參數(shù)下采集9例檢測(cè)抗體標(biāo)記單陽(yáng)樣品，驗(yàn)證補(bǔ)償條件無(wú)誤，確定補(bǔ)償參數(shù)。

2 結(jié)果

檢測(cè)顯示，補(bǔ)償前群體模糊不清，無(wú)法確定檢測(cè)數(shù)據(jù)質(zhì)量，使用確定好的補(bǔ)償參數(shù)對(duì)9 色樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行熒光補(bǔ)償，補(bǔ)償后見(jiàn)圖1，其中藍(lán)色門圈選CD4+CD45RA-輔助T 淋巴細(xì)胞的效應(yīng)群體，對(duì)比補(bǔ)償前后圖可見(jiàn)細(xì)胞群體的位移。此方法獲取的9色標(biāo)記數(shù)據(jù)，各通道熒光溢漏擴(kuò)散均較理想，陰性、陽(yáng)性群體區(qū)分明顯，各細(xì)胞群體指標(biāo)顯示清晰，可完成無(wú)重復(fù)采集的多色樣品分析。

圖1 CD4 單陽(yáng)參考品輔助檢測(cè)九色標(biāo)記人血樣品

圖1 （續(xù)）

3 討論

多參數(shù)流式檢測(cè)具有參數(shù)多、速度快、影響因素多、分析難度大、數(shù)據(jù)質(zhì)量要求高等特點(diǎn)[3]，在流式實(shí)驗(yàn)中是檢測(cè)難度最高的一類。通常在多色流式檢測(cè)時(shí)，需要實(shí)驗(yàn)人員在采樣的短暫過(guò)程中，憑借經(jīng)驗(yàn)對(duì)多個(gè)參數(shù)完成人為設(shè)置。本實(shí)驗(yàn)中，可以看到在檢測(cè)過(guò)程中，即使是在最優(yōu)的檢測(cè)參數(shù)下，操作者也只能觀察到未經(jīng)補(bǔ)償?shù)碾s亂群體，既無(wú)法判斷分群情況，更無(wú)法估計(jì)熒光溢漏擴(kuò)散的情況。因此，通常是手動(dòng)調(diào)節(jié)參數(shù)后采集少量樣品，運(yùn)行補(bǔ)償程序，采集單陽(yáng)對(duì)照，計(jì)算補(bǔ)償后代入預(yù)試，根據(jù)補(bǔ)償后群體分布情況調(diào)整電壓，往往需要反復(fù)調(diào)整多次，才能使數(shù)據(jù)較為理想，但是既浪費(fèi)樣品，又耗費(fèi)時(shí)間，并且由于主觀分析的隨意性和調(diào)整時(shí)間的局限，往往不能達(dá)到最佳的檢測(cè)參數(shù)。對(duì)于流式多色檢測(cè)，指標(biāo)眾多，群體數(shù)量巨大，檢測(cè)中要求盡可能清楚區(qū)分所有的群體，就必須注重溢漏擴(kuò)散的干擾。溢漏擴(kuò)散主要來(lái)自于檢測(cè)器的干擾信號(hào)，只有使用信噪比盡可能高的檢測(cè)參數(shù)才能得到更小的溢漏擴(kuò)散，才能最大限度的將陽(yáng)性和弱陽(yáng)性群體從背景中分離出來(lái)[4，5]。本方法利用了流式儀器通道的性能特點(diǎn)，利用BD 公司的CD4 抗體參考品試劑盒，預(yù)先利用光譜匹配，陽(yáng)性明確的單色樣品，分析確定各不同檢測(cè)參數(shù)下檢測(cè)通道的性能表現(xiàn)，選取各通道的最佳檢測(cè)參數(shù)，在實(shí)際檢測(cè)中以最優(yōu)參數(shù)為參考，僅需要對(duì)少數(shù)超出界限的通道進(jìn)行微調(diào)，降低檢測(cè)參數(shù)至檢測(cè)器線性范圍上限即可，大大地減少了多色分析中實(shí)驗(yàn)人員的主觀分析步驟，不需要反復(fù)多次上樣，節(jié)約樣品，可有效提高數(shù)據(jù)質(zhì)量。

本研究采用的參考樣品為人血細(xì)胞抗CD4 單陽(yáng)性標(biāo)記樣品，在人免疫細(xì)胞表面分布的蛋白標(biāo)志物中，CD4 分子數(shù)量中等，是良好的陽(yáng)性參考，可以代表一般的檢測(cè)指標(biāo)狀態(tài)，并且是實(shí)驗(yàn)室常用抗體，容易獲得。本次使用的組合參考品試劑盒中CD4 抗體為同一克隆，且抗體均經(jīng)過(guò)滴定，反應(yīng)條件一致，由CD4 單陽(yáng)標(biāo)品檢測(cè)得到的檢測(cè)通道信噪比最佳檢測(cè)電壓是檢測(cè)器的物理參數(shù)[6]，每臺(tái)儀器都有固定的數(shù)值，理論上適合所有指標(biāo)的檢測(cè)，可以作為多色分析的初設(shè)參數(shù)，但一些極高表達(dá)指標(biāo)有可能產(chǎn)生超出檢測(cè)器線性范圍的熒光信號(hào)，這時(shí)信號(hào)無(wú)法準(zhǔn)確補(bǔ)償，因此檢測(cè)中需要確保檢測(cè)信號(hào)線性度，只需要在上樣過(guò)程中根據(jù)樣品信號(hào)的實(shí)際情況，快速將超限通道的電壓降低，使信號(hào)進(jìn)入檢測(cè)器線性范圍，微調(diào)之后的檢測(cè)電壓即是適合本實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的最佳檢測(cè)參數(shù)。對(duì)于低表達(dá)指標(biāo)一般不需要調(diào)高檢測(cè)器電壓，因?yàn)榉炊鴷?huì)使信噪比下降，降低通道的分辨力[7]。在上述樣中僅需對(duì)少數(shù)超限通道調(diào)低電壓即可，不需要反復(fù)上樣，節(jié)省了樣品細(xì)胞和時(shí)間。

使用優(yōu)化后的參數(shù)完成采樣后樣品數(shù)據(jù)仍無(wú)法直接分析，由于流式儀器通道之間的熒光滲漏，各通道的信號(hào)互相混雜無(wú)法準(zhǔn)確辨認(rèn)，需要準(zhǔn)確的計(jì)算補(bǔ)償[8，9]。熒光補(bǔ)償是對(duì)不同通道之間熒光滲漏的調(diào)整操作，目的是盡可能將通道中的漏光排除，保證各通道信號(hào)的特異性，在多色分析中對(duì)于一個(gè)數(shù)據(jù)給予不同的補(bǔ)償參數(shù)可能會(huì)得到完全不同的分析結(jié)果，因此補(bǔ)償數(shù)據(jù)也很關(guān)鍵[9]。一般流式檢測(cè)常用單陽(yáng)樣品，確定各通道的漏光與檢測(cè)信號(hào)熒光的比例進(jìn)行補(bǔ)償，但是在多參數(shù)流式實(shí)驗(yàn)中通常會(huì)包括一些表達(dá)量低或者陽(yáng)性比例低的指標(biāo)，如CD127、CD25、CD197，這些指標(biāo)的檢測(cè)通道和漏光通道上的信號(hào)較弱，不容易獲得滿意的補(bǔ)償數(shù)據(jù)，因此往往使用較強(qiáng)的單陽(yáng)樣品代替（如補(bǔ)償微球）。本研究使用相同熒光素標(biāo)記的CD4 單陽(yáng)代替，雖然抗體標(biāo)記蛋白不同，但是熒光素相同（同一廠家），光譜穩(wěn)定，可以替代使用。同時(shí)，由于各色的CD4 標(biāo)記細(xì)胞為相同群體，補(bǔ)償時(shí)的細(xì)胞熒光本底更為一致，結(jié)果與使用補(bǔ)償微球計(jì)算的結(jié)果近似，且檢測(cè)信號(hào)分布在線性范圍之內(nèi)，避免了微球補(bǔ)償時(shí)陽(yáng)性群體信號(hào)超出檢測(cè)器線性范圍的情況[10，11]。為了使計(jì)算的補(bǔ)償參數(shù)更加匹配檢測(cè)樣品的實(shí)際情況，本次使用檢測(cè)抗體標(biāo)記的單陽(yáng)樣品代入補(bǔ)償值驗(yàn)證，對(duì)有明顯偏差的通道可手工微調(diào)，使補(bǔ)償與各單陽(yáng)樣品標(biāo)記吻合，再將修正的補(bǔ)償應(yīng)用到多色數(shù)據(jù)上，即可獲得清晰的補(bǔ)償后數(shù)據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)化的檢測(cè)參數(shù)一次完成9 色樣品的分析與補(bǔ)償，分析結(jié)果群體區(qū)分清晰，避免了傳統(tǒng)主觀調(diào)試的反復(fù)上樣調(diào)整，節(jié)省了細(xì)胞樣品，可以保證檢測(cè)通道達(dá)到理想的信噪比和分辨力，同時(shí)簡(jiǎn)便可靠的計(jì)算補(bǔ)償，提高多色數(shù)據(jù)質(zhì)量，方便操作者快速準(zhǔn)確的完成多參數(shù)流式的檢測(cè)。

綜上所述，通過(guò)對(duì)相同光譜的一系列CD4 標(biāo)記單陽(yáng)參考樣品以遞增檢測(cè)參數(shù)重復(fù)分析，獲得各通道檢測(cè)器性能數(shù)據(jù)，依據(jù)流式細(xì)胞儀的檢測(cè)器性能特點(diǎn)，簡(jiǎn)便快速的確定各通道最佳檢測(cè)參數(shù)，避免操作者主觀判斷失誤，結(jié)合自動(dòng)補(bǔ)償和補(bǔ)償驗(yàn)證步驟，確保準(zhǔn)確合理的補(bǔ)償，提高流式多色數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量，使流式分析的結(jié)果更加準(zhǔn)確、客觀，同時(shí)節(jié)省細(xì)胞樣品。