梅娥,呂明珠,海本剛

(1.十堰市婦幼保健院，湖北 十堰 442000； 2.湖北醫(yī)藥學院 附屬東風醫(yī)院，湖北 十堰 442000；3.十堰市鄖陽區(qū)婦幼保健院，湖北 十堰 442000)

小兒腎母細胞瘤是兒童常見的惡性腫瘤之一，全球每年的發(fā)病率為1/10萬[1]。近年來隨著治療方法的優(yōu)化，小兒腎母細胞瘤的預后已得到明顯改善，但抑制其復發(fā)和轉(zhuǎn)移一直是臨床研究熱點[2]。研究發(fā)現(xiàn)，小兒腎母細胞瘤患兒被診斷為糖尿病的風險顯著增加[3]，表明小兒腎母細胞瘤與糖尿病之間存在一定的相關性。探究兩者的潛在關系也是治療小兒腎母細胞瘤必須解決的重要問題。B細胞特異性MLV整合位點- 1(Bmi1)是胚胎發(fā)育信號系統(tǒng)中重要的調(diào)控因子[4]。Duan等[5]發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖誘導胰腺癌細胞的Bmi1表達升高，進而降低自然殺傷細胞(NK細胞)對胰腺癌細胞的免疫殺傷敏感性，說明Bmi1在葡萄糖調(diào)控NK細胞殺傷腫瘤細胞中具有重要作用。近年研究顯示，Bmi1在小兒腎母細胞瘤中高表達，且與腫瘤的預后及轉(zhuǎn)移相關[6]。目前有關Bmi1與NK細胞對小兒腎母細胞瘤殺傷敏感性的研究尚未見報道，本研究通過觀察Bmi1在小兒腎母細胞瘤組織和細胞中的表達，闡明不同濃度葡萄糖作用下，Bmi1表達變化及沉默Bmi1對NK細胞殺傷小兒腎母細胞瘤細胞敏感性的影響，以期為臨床探究小兒腎母細胞瘤免疫逃逸提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織樣本、細胞株及主要試劑

25例腫瘤組織樣本均來自十堰市婦幼保健院2018年3月至2020年2月收治的小兒腎母細胞瘤病例。所有患兒術后病理診斷皆為小兒腎母細胞瘤，術前未行化療或放療，且所有患兒監(jiān)護人已簽署知情同意書。本研究獲得十堰市婦幼保健院倫理委員會的批準。組織樣本均保存于-80 ℃。腎母細胞瘤細胞G401和胚腎細胞CCC- HEK- 1均購自中國科學院上海細胞生物學研究所，McCoy’s 5A培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，淋巴細胞分離液購自上海信裕生物科技有限公司，NK細胞培養(yǎng)基購自武漢普諾賽生命科技有限公司，PE標記的CD3、FITC標記的CD56、NKG2D單抗、MHCⅠ類多肽相關序列A(MICA)及MICB單抗均購自美國BD公司，Trizol試劑和實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT- PCR)試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，對照小干擾RNA(si- NC)、Bmi1小干擾RNA(si- Bmi1)、LipofectamineTM 3000及BCA 蛋白定量試劑盒均購自美國Invitrogen公司；Bmi1抗體、二抗(羊抗兔)和乳酸脫氫酶(LDH)釋放檢測試劑盒均購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及小干擾RNA轉(zhuǎn)染

CCC- HEK- 1細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；G401細胞用含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。收集對數(shù)生長期的G401細胞，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至3.0×106個·ml-1，接種于6孔板內(nèi)。按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將50 ng的si- NC、si- Bmi1分別轉(zhuǎn)染G401細胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基。在高濃度葡萄糖刺激實驗中，含胎牛血清的培養(yǎng)基中分別加葡萄糖至終濃度為5、10、15 mmol·L-1。

1.3 NK細胞的分離及鑒定

依據(jù)淋巴細胞分離液實驗步驟分離3例健康人外周血單個核細胞，加入NK細胞培養(yǎng)基置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。PBS洗滌重懸NK細胞，調(diào)整細胞濃度至1×107個·ml-1，依次加入PE標記的CD3抗體、FITC標記的CD56抗體，室溫避光條件下孵育20 min，PBS重懸細胞后利用流式細胞儀檢測NK細胞表型。

1.4 免疫組化法檢測Bmi1的表達

將獲得的小兒腎母細胞瘤組織樣本和瘤旁正常組織進行常規(guī)石蠟切片，切片脫蠟后蒸餾水浸洗1 min，對切片進行抗原修復，滴加3%的H2O2于組織切片，室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗。滴加稀釋的山羊血清，室溫孵育40 min，滴加Bmi1抗體，4 ℃孵育過夜。PBS沖洗切片，滴加二抗37 ℃孵育25 min。PBS沖洗切片，滴加DAB顯色液，自來水沖洗終止染色，加入Harris蘇木素復染1 min，水洗后用1%的鹽酸酒精分化，再用自來水水洗返藍。將切片進行梯度酒精脫水后，再依次滴加二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ，封片劑封片后晾干、鏡檢、拍照。

1.5 qRT- PCR檢測Bmi1、MICA及MICB的mRNA表達

Trizol試劑提取組織樣本或細胞的總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒一步法進行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)熒光定量試劑盒所述實驗方法進行qRT- PCR反應，引物序列見表1。反應條件為：95 ℃變性15 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸10 s，進行40個循環(huán)。擴增結(jié)果采用2-ΔΔCt法計算Bmi1、MICA及MICB的mRNA相對表達量。

表1 qRT- PCR引物序列

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測Bmi1、MICA及MICB的蛋白表達

RIPA細胞裂解液裂解已轉(zhuǎn)染的G401細胞，提取細胞總蛋白，利用BSA法檢測細胞蛋白濃度。取120 μg 蛋白進行變性，10%分離膠進行SDS- PAGE電泳分離等量蛋白，將目標蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶4 ℃封閉1 h，TBST洗膜5 min共3次，加入Bmi1、MICA和MICB抗體(1∶1 500)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜5 min共3次，加入HRP標記的兔抗鼠的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，TBST洗膜5 min共5次。顯影曝光，利用Image- Pro Plus圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.7 流式細胞術檢測NKG2D配體MICA、MICB的表達

收集G401細胞，PBS重懸洗滌細胞，以5.5×104個·ml-1的濃度接種于96孔板內(nèi)。根據(jù)每106個細胞1 μg的濃度加入MICA和MICB抗體，4 ℃孵育細胞25 min，PBS洗滌細胞，加入FITC標記的山羊抗鼠二抗4 ℃孵育30 min，PBS洗滌3次，利用流式細胞儀分析陽性細胞。

1.8 LDH法檢測NK細胞對G401細胞的殺傷敏感性

根據(jù)實驗目的，胰酶消化葡萄糖處理或轉(zhuǎn)染的G401細胞(靶細胞)，利用含無胎牛血清的McCoy’s 5A培基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至4×105個·ml-1。收集NK細胞，PBS洗滌重懸細胞，NKG2D單抗孵育NK細胞20 min。PBS洗滌NK細胞及NKG2D單抗孵育的NK細胞(效應細胞)，使用含無胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至8×106個·ml-1。按照效靶比20∶1將細胞加入96孔板內(nèi)，為實驗組。同時設置效應細胞自然釋放組、靶細胞自然釋放組及靶細胞最大釋放組。每組各設置6個復孔。將96孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，離心后每孔吸取100 μl細胞上清置于96孔板，每孔加入100 μl的LDH溶液作用5 min，加入1 mol·L-1的鹽酸，利用酶標儀在490 nm處檢測光密度值(OD值)。殺傷敏感性=(實驗組OD值-效應細胞自然釋放組OD值)/(靶細胞最大釋放組OD值-靶細胞自然釋放組OD值)×100%。

1.9 統(tǒng)計學處理

統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0軟件，取3次獨立實驗結(jié)果，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差表示，組間兩兩比較采用t檢驗，多組間雙因素比較采用Two- way ANOVA分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 Bmi1蛋白在小兒腎母細胞瘤組織及細胞中的表達

免疫組化實驗結(jié)果顯示，Bmi1在小兒腎母細胞瘤瘤旁正常組織中表達微弱，而在瘤組織中過度表達，見圖1。

圖1 小兒腎母細胞瘤組織和瘤旁正常組織Bmi1蛋白表達的免疫組化染色結(jié)果(×200) A.瘤旁正常組織； B. 小兒腎母細胞瘤組織

2.2 Bmi1蛋白在腎母細胞瘤細胞G401和胚腎細胞CCC- HEK- 1中的表達

qRT- PCR及蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果顯示，腎母細胞瘤細胞G401中Bmi1蛋白和mRNA表達水平高于胚腎細胞CCC- HEK- 1(P<0.01)，見表2。

表2 G401細胞和CCC- HEK- 1細胞中Bmi1蛋白及mRNA的表達水平比較

2.3 不同濃度葡萄糖對G401細胞中Bmi1表達的影響

qRT- PCR及蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果顯示，隨著葡萄糖濃度的增加，G401細胞中Bmi1 mRNA及蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，見表3。

表3 不同濃度葡萄糖對G401細胞中Bmi1蛋白及mRNA表達的影響

2.4 不同濃度葡萄糖對G401細胞中MICA和MICB表達的影響

qRT- PCR及蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果顯示，隨著葡萄糖濃度的增加，G401細胞中MICA和MICB的蛋白及mRNA表達水平逐漸降低(P<0.05)，見表4。流式細胞實驗結(jié)果顯示，隨著葡萄糖濃度的增加，G401細胞的MICA和MICB表達水平逐漸降低，見圖2。

圖2 不同濃度葡萄糖對G401細胞中MICA和MICB表達的影響 A、B、C、D深色曲線依次為0、5、10、15 mmol·L-1濃度的葡萄糖，淺色曲線為IgG對照

表4 不同濃度葡萄糖對G401細胞中MICA和MICB蛋白及mRNA表達的影響

2.5 沉默Bmi1對高濃度葡萄糖處理的G401細胞中MICA和MICB表達的影響

由于15 mmol·L-1葡萄糖處理G401細胞后Bmi1蛋白表達最高，MICA和MICB蛋白表達最低，因此選擇15 mmol·L-1葡萄糖處理的G401細胞作為此實驗細胞。qRT- PCR及蛋白質(zhì)印跡實驗結(jié)果顯示，與si- NC相比，si- Bmi1促進G401細胞中MICA和MICB的蛋白及mRNA的表達(P<0.05)，見表5。流式細胞實驗結(jié)果顯示，與si- NC相比，si- Bmi1促進G401細胞中MICA和MICB的表達，見圖3。

圖3 沉默Bmi1對高濃度葡萄糖處理的G401細胞中MICA及MICB表達的影響 A.MICA； B. MICB

表5 沉默Bmi1對高濃度葡萄糖處理的G401細胞中MICA和MICB蛋白及mRNA表達的影響

2.6 NK細胞純度鑒定

流式細胞實驗結(jié)果顯示，CD3-CD56+的NK細胞純度達到90%以上，見圖4。

圖4 CD3-CD56+的NK細胞

2.7 不同濃度葡萄糖對NK細胞殺傷G401細胞敏感性的影響

LDH實驗結(jié)果顯示，NK細胞對無葡萄糖及含5、10、15 mmol·L-1葡萄糖的G401細胞的殺傷率依次為52.11及41.37、18.42、10.03，表明隨著葡萄糖濃度的升高，NK細胞對G401細胞的殺傷敏感性降低(P<0.05)。

2.8 沉默Bmi1對NK細胞殺傷高濃度葡萄糖處理的G401細胞敏感性的影響

由于15 mmol·L-1葡萄糖對NK細胞殺傷G401細胞的抑制作用最強，因此選擇15 mmol·L-1葡萄糖處理的G401細胞作為此實驗細胞。LDH實驗結(jié)果顯示，NK細胞對si- NC組G401細胞的殺傷率為11.13±0.23，對si- Bmi1組G401細胞的殺傷率為32.16±0.27，兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.9 NKG2D抗體對NK細胞殺傷G401細胞敏感性的影響

LDH實驗結(jié)果顯示，NKG2D抗體封閉NK細胞表面的NKG2D受體，NK細胞對高濃度葡萄糖處理的G401細胞的殺傷敏感性低于單抗阻斷前(P<0.05)。比較抗體封閉前后不同葡萄糖濃度下NK細胞對G401細胞的殺傷敏感性差異也具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表6。此外，NK細胞對沉默Bmi1后的高濃度(15 mmol·L-1)葡萄糖處理的G401細胞的殺傷敏感性低于單抗阻斷前(P<0.05)，見表7。

表6 NKG2D抗體對NK細胞殺傷不同濃度葡萄糖作用的G401細胞敏感性的影響

表7 NKG2D抗體對NK細胞殺傷沉默Bmi1高濃度葡萄糖處理的G401細胞敏感性的影響

3 討 論

小兒腎母細胞瘤是小兒泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率約占小兒實體瘤的8%[7]。研究顯示，小兒腎母細胞瘤患兒在治療過程中機體糖代謝異常，導致患兒患糖尿病的概率增加[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)，機體內(nèi)高濃度的葡萄糖會抑制NK細胞的數(shù)量和功能[9- 10]。NK是機體重要的淋巴細胞，在抑制腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，因此探究高濃度葡萄糖對小兒腎母細胞瘤免疫逃逸的影響是十分必要的。

Bmi1是PRC1家族的主要成員之一，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮促癌因子的作用[11- 12]。最新研究顯示，高濃度葡萄糖可通過Bmi1促進胰腺癌細胞逃避NK細胞的免疫殺傷[5]。本研究發(fā)現(xiàn)Bmi1在小兒腎母細胞瘤組織和G401細胞中高表達，隨著葡萄糖濃度的升高，G401細胞中Bmi1表達量也隨之升高，說明高濃度葡萄糖可促進G401細胞中Bmi1的表達。

Duan等[5]研究發(fā)現(xiàn)，過表達Bmi1通過抑制MICA和MICB表達，降低NK細胞對胰腺癌細胞的殺傷敏感性。NK細胞表面關鍵的活化性抗體NKG2D與腫瘤細胞表面活化性受體NKG2DL(MICA和MICB)結(jié)合，給予NK細胞活化性信號，直接殺傷腫瘤細胞。近年研究發(fā)現(xiàn)，高濃度葡萄糖參與調(diào)控NK細胞對腫瘤細胞的殺傷敏感性[13]。連小珂等[14]研究發(fā)現(xiàn)，消化系統(tǒng)惡性腫瘤患者體內(nèi)的高血糖會抑制NK細胞數(shù)量及其功能的發(fā)揮。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的葡萄糖抑制G401細胞中MICA和MICB的表達，并降低NK細胞對G401細胞的殺傷敏感性；在機制探討部分，我們著重研究Bmi1在其中發(fā)揮的作用。研究發(fā)現(xiàn)沉默Bmi1可逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖對MICA和MICB表達及NK細胞殺傷G401細胞敏感性的抑制作用。此外，利用NKG2D抗體作用于NK細胞發(fā)現(xiàn)，NK細胞對高濃度葡萄糖處理的G401細胞及沉默Bmi1的高濃度葡萄糖處理的G401細胞的殺傷敏感性均降低。這表明，高濃度葡萄糖是通過Bmi1抑制G401細胞MICA及MICB的表達，減少G401細胞表面MICA及MICB與NK細胞表面MG2D的結(jié)合，抑制NK細胞對G401細胞的殺傷敏感性。

綜上所述，Bmi1在小兒腎母細胞瘤組織及腎母細胞瘤細胞G401中高表達，高濃度葡萄糖促進Bmi1的表達，抑制MICA和MICB的表達，降低NK細胞對G401細胞的殺傷敏感性，沉默Bmi1可逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖對MICA和MICB表達及NK細胞殺傷G401細胞敏感性的抑制作用，這可為進一步探討小兒腎母細胞瘤免疫逃逸機制提供新的思路。