張琦，孫鵬，郭陽(yáng)，谷月舜

(1.陽(yáng)谷縣人民醫(yī)院 麻醉科，山東 聊城 252300； 2.陽(yáng)谷縣人民醫(yī)院 普外科，山東 聊城 252300；3.聊城市人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，山東 聊城 252000)

全球范圍內(nèi)，肝癌的病死率占所有惡性腫瘤疾病的第3位，盡管近年來(lái)肝癌的早期診斷和治療技術(shù)有一定的進(jìn)步，但肝癌患者預(yù)后并不樂(lè)觀，術(shù)后轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率仍處于較高水平[1]。因此，探究肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)機(jī)制，將對(duì)靶向治療藥物的開(kāi)發(fā)有重要意義。丙泊酚是臨床常用的靜脈麻醉藥物，可用于腫瘤根治術(shù)的全身麻醉，據(jù)報(bào)道，丙泊酚對(duì)肝癌[2]、胃癌[3]、子宮內(nèi)膜癌[4]等多種惡性腫瘤均具有抑制作用。周橋靈等[5]研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲，可能與抑制磷脂酰肌醇3- 激酶/蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶信號(hào)通路的激活有關(guān)。但丙泊酚在肝癌中是否還有其他的作用途徑尚不明確。本研究通過(guò)探究丙泊酚對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其分子機(jī)制，以期為肝癌的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞來(lái)源

人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)自上海細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)研究所。

1.2 藥品與主要試劑

丙泊酚注射液(北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20171055，規(guī)格為每支20 ml)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒- 8(cell counting kit- 8，CCK- 8)、蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)，磷脂結(jié)合蛋白V- 異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V- fluorescein Isothiocyanate/ propidium iodide，Annexin V- FITC/PI)凋亡試劑盒(南京建成生物工程研究所)，基質(zhì)膠、轉(zhuǎn)移小室(美國(guó)BD)，切割后天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase- 3，ab214430)、B淋巴細(xì)胞腫瘤- 2(B- cell lymphoma- 2，Bcl- 2，ab196495)、Bcl- 2相關(guān)蛋白X(Bcl2- associated X,Bax，ab3191)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)- 2(ab92536)、MMP- 9(ab228402)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3，ab119352)、磷酸化STAT3(STAT3 phosphorylation，p- STAT3，ab76315)蛋白抗體(美國(guó)Abcam)，Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen)，熒光定量試劑盒(日本TaKaRa)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基混勻HepG2細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天采用0.25%胰蛋白酶液消化細(xì)胞，按1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。密切觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和丙泊酚低、中、高劑量處理組，對(duì)照組添加正常培養(yǎng)基，丙泊酚處理組分別添加10、25、50 μg·ml-1丙泊酚[6]，處理后置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞增殖能力測(cè)定 各組細(xì)胞接種96孔板，處理結(jié)束后分別培養(yǎng)24、48、72 h，添加CCK- 8試劑繼續(xù)培養(yǎng)4 h，經(jīng)iMark酶標(biāo)儀(美國(guó)RioRad)檢測(cè)570 nm處光密度(OD)值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[=(1-OD丙泊酚處理組)/OD對(duì)照組×100%]。

1.3.3 細(xì)胞凋亡測(cè)定 收集各組處理后細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×106個(gè)·ml-1，加入結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，混勻后分別加入AnnexinV- FITC、PI染液，4 ℃避光條件下孵育30 min，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.3.4 細(xì)胞侵襲能力測(cè)定 預(yù)先將基質(zhì)膠鋪于轉(zhuǎn)移小室上室，凝固后添加處理后的細(xì)胞(無(wú)血清培養(yǎng)基)，下室添加含有20%胎牛血清的培養(yǎng)基，正常條件培養(yǎng)24 h。將轉(zhuǎn)移小室固定于4%多聚甲醛中，再經(jīng)結(jié)晶紫染色10 min，用棉簽輕輕拭去上室細(xì)胞，光鏡(日本Olympus)下計(jì)數(shù)并拍攝下室細(xì)胞。

1.3.5 細(xì)胞遷移能力測(cè)定 收集各組處理后細(xì)胞鋪于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，用1 ml槍頭于培養(yǎng)孔中線垂直劃線，洗去脫落細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，于0、24 h時(shí)拍照記錄，以細(xì)胞劃痕修復(fù)速度表示遷移率[=(劃痕距離24 h-劃痕距離0 h)/劃痕距離0 h×100%]。

1.3.6 細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)測(cè)定 收集各組處理后細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，經(jīng)蛋白質(zhì)定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后，各組取等量蛋白進(jìn)行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，再將凝膠切成合適大小轉(zhuǎn)移至PVDF膜，置于5%脫脂奶粉中封閉非特異性位點(diǎn)，分別加入1∶1 000稀釋的蛋白一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，再加入1∶10 000稀釋的蛋白二抗，37 ℃孵育40 min，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯示蛋白條帶，以目的蛋白條帶灰度值與甘油醛- 3- 磷酸脫氫酶(glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase, GAPDH)條帶灰度值比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.3.7 細(xì)胞中miR- 637表達(dá)測(cè)定 收集各組處理后細(xì)胞，加入Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)微量核酸儀檢測(cè)樣品RNA純度和濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA鏈，參照熒光定量試劑盒配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共38個(gè)循環(huán)，miR- 637相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。miR- 637上游引物序列5′- ACUGGGGGCUUUCGGGCUCUGCGU- 3′，下游引物序列5′- ACGCAGAGCCCGAAAGCCCCCAGU- 3′；U6上游引物序列5′- CGCTTCGGCAGCACATATTAC- 3′，下游引物序列5′- TTCACGAATTTGCGTGTCCAT- 3′[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞增殖情況

隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組細(xì)胞的增殖抑制率均逐漸升高。同一培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)，丙泊酚處理組細(xì)胞增殖抑制率較對(duì)照組升高(P<0.05)，且不同劑量丙泊酚處理組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組HepG2細(xì)胞增殖抑制率的比較

2.2 細(xì)胞凋亡情況

如圖1，對(duì)照組和丙泊酚低、中、高劑量處理組細(xì)胞凋亡率分別為(0.35±0.11)%和(4.21±0.62)%、(9.48±2.35)%、(19.47±4.17)%，各組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=58.941，P<0.001)。丙泊酚處理組細(xì)胞增殖抑制率較對(duì)照組升高(P<0.05)，不同劑量丙泊酚處理組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組HepG2細(xì)胞凋亡情況

2.3 細(xì)胞侵襲與遷移情況

丙泊酚處理組侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移率較對(duì)照組降低(P<0.05)，且不同劑量丙泊酚處理組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2、表2。

表2 各組HepG2細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和遷移率的比較

圖2 各組HepG2細(xì)胞侵襲與遷移情況 A.各組HepG2細(xì)胞侵襲情況(×400)； B.各組HepG2細(xì)胞遷移情況

2.4 細(xì)胞凋亡、侵襲及遷移相關(guān)蛋白的表達(dá)

丙泊酚處理組中cleaved caspase- 3表達(dá)較對(duì)照組升高，Bcl- 2/Bax、MMP- 2及MMP- 9水平較對(duì)照組降低(P<0.05)，且不同劑量丙泊酚處理組間cleaved caspase- 3、Bcl- 2/Bax、MMP- 2及MMP- 9水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖3、表3。

1、2、3、4依次為對(duì)照組及丙泊酚低、中、高劑量處理組

2.5 細(xì)胞中miR- 637/STAT3表達(dá)情況

丙泊酚處理組細(xì)胞中miR- 637表達(dá)較對(duì)照組升高，p- STAT3/STAT3水平較對(duì)照組降低(P<0.05)，且不同劑量丙泊酚處理組間miR- 637、p- STAT3/STAT3水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表4。

1、2、3、4依次為對(duì)照組及丙泊酚低、中、高劑量處理組

表4 各組HepG2細(xì)胞中miR- 637/STAT3表達(dá)的比較

3 討 論

近期研究顯示，丙泊酚在調(diào)節(jié)圍手術(shù)期免疫與腫瘤的相互作用中有重要作用，可延長(zhǎng)各種類型腫瘤患者的生存時(shí)間[8]。Yu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可促進(jìn)miR- 328表達(dá)，抑制去整合素金屬蛋白酶8的表達(dá)，從而抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。維持長(zhǎng)期增殖和運(yùn)動(dòng)能力是癌細(xì)胞最根本的特性，本研究以HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，檢測(cè)了丙泊酚對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響，結(jié)果顯示，丙泊酚可顯著抑制HepG2細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。Sun等[10]研究也顯示，丙泊酚可調(diào)控肝細(xì)胞癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自主死亡過(guò)程，涉及凋亡誘導(dǎo)因子和凋亡抑制因子等調(diào)節(jié)因子的相互作用，對(duì)維持機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化及病理生理狀態(tài)有重要作用。正常情況下，細(xì)胞線粒體中Bcl- 2與Bax結(jié)合形成二聚體抑制細(xì)胞調(diào)亡；當(dāng)受到外界刺激后，Bax水平升高形成更多的二聚體，聚集于線粒體膜增加其通透性，致使多種凋亡因子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[11]。MMP- 2和MMP- 9是MMPs家族中降解Ⅳ型膠原主要的酶類，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜、促進(jìn)新生血管生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附作用等作用，可參與腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移的調(diào)控[12]。研究報(bào)道，肝癌中MMP- 2和MMP- 9表達(dá)升高，其表達(dá)水平與肝癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制有關(guān)，抑制其表達(dá)可顯著降低肝癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[13]。Kang等[14]應(yīng)用丙泊酚處理MA- 10小鼠間質(zhì)瘤細(xì)胞，結(jié)果顯示，丙泊酚可能通過(guò)激活caspase通路，抑制MA- 10細(xì)胞中蛋白質(zhì)絲氨酸蘇氨酸激酶信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)其凋亡。吳悠等[15]研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1，下調(diào)MMP- 9水平，抑制乳腺癌細(xì)胞MCF- 7細(xì)胞遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果表明，丙泊酚可上調(diào)cleaved caspase- 3表達(dá)，下調(diào)Bcl- 2/Bax、MMP- 2和MMP- 9表達(dá)，誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡，并抑制其侵襲與遷移。

miRNAs通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶基因信使RNA的3′- UTR結(jié)合，介導(dǎo)靶基因的表達(dá)，從而在腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和對(duì)藥物的敏感程度中起調(diào)控作用。據(jù)報(bào)道，miR- 637在肝癌、甲狀腺癌中表達(dá)下調(diào)，miR- 637過(guò)表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為[16- 17]。STATs是一類細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與細(xì)胞的增殖、分化、炎癥反應(yīng)及免疫反應(yīng)等過(guò)程[18]。STAT3作為STATs成員，可促進(jìn)細(xì)胞持續(xù)性增殖，在惡性腫瘤中呈過(guò)度或持續(xù)激活狀態(tài)。Huang等[19]研究顯示，STAT3是miR- 637的靶基因，在骨肉瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制中有重要作用。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可介導(dǎo)EGFR/JAK2/ STAT3通路，增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，采用丙泊酚處理后，細(xì)胞中miR- 637水平上調(diào)，STAT3磷酸化水平下調(diào)，提示丙泊酚可能介導(dǎo)miR- 637/STAT3軸，抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。

綜上所述，丙泊酚可介導(dǎo)miR- 637/STAT3軸，抑制肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移，并誘導(dǎo)其凋亡。但本研究?jī)H在細(xì)胞水平檢測(cè)丙泊酚的作用，后期考慮選用動(dòng)物模型，深入分析丙泊酚在肝癌中的作用。