眭怡群，張永勝

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院 病理科，江蘇 蘇州 215004)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病隱匿，缺乏有效的治療手段，致死率高，因此了解卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子機制并制定新的治療策略十分重要。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度19～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶mRNA的3′端非編碼區(qū)特異性結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平上對目的基因表達進行負調(diào)控[1]。miRNA異常表達與腫瘤的關聯(lián)是目前的研究熱點。近來的研究表明miR- 4324的異常表達參與了多種腫瘤的生物學過程。Li等[2]研究表明，miR- 4324通過靶向HOXB2基因，從而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生。Inamoto等[3]報道m(xù)iR- 4324的表達與膀胱尿路上皮癌患者的預后有關。陳軍瑩等[4]發(fā)現(xiàn)，與正常宮頸組織相比，宮頸鱗狀細胞癌組織中miR- 4324表達下調(diào)。目前miR- 4324在卵巢癌中的研究尚未見報道，作者旨在利用生物信息學研究miR- 4324在卵巢癌中的表達，并進一步分析miR- 4324在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 提取卵巢癌中miRNA表達數(shù)據(jù)

從GEO數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，http:∥www.ncbi.nlm.nih. gov/ GEO/)中篩選并下載卵巢癌miRNA表達的數(shù)據(jù)集GSE83693和GSE119055,評估卵巢癌中miR- 4324表達情況。數(shù)據(jù)集GSE83693包括8例原發(fā)性卵巢癌組織、8例復發(fā)性卵巢癌組織和4例正常卵巢組織。數(shù)據(jù)集GSE119055包括 6例卵巢癌組織和3例正常卵巢組織。

1.2 分析卵巢癌中miR- 4324的表達水平

用GEO2R在線工具(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO2R/)基于R軟件“LIMMA”包篩選卵巢癌組織和正常卵巢組織之間差異表達的miRNAs(DE- miRNAs)，分為4個不同的組，其中數(shù)據(jù)集GSE83693分成3個組，分別為4例正常卵巢組織與8例原發(fā)性卵巢癌組織(83693NP組)、4例正常卵巢組織與8例復發(fā)性卵巢癌組織(83693NR組)、4例正常卵巢組織與16例(原發(fā)+復發(fā))卵巢癌組織(83693NC組)，最后1個組是數(shù)據(jù)集GSE119055中3例正常卵巢組織與6例卵巢癌組織(119055組)。篩選閾值為| log2FC |>1和adjP<0.05，4組分別得到各自差異表達的miR- 4324。

1.3 預測miR- 4324的下游靶基因(TG- miR4324)

利用TargetScan數(shù)據(jù)庫(www.targetscan.org/vert_72)預測miR- 4324的TG- miR4324。

1.4 提取卵巢癌中mRNA表達數(shù)據(jù)

從GEO數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，http:∥www.ncbi.nlm.nih. gov/GEO/)中下載卵巢癌mRNA表達的數(shù)據(jù)集GSE66957和GSE14407，篩選并識別卵巢癌中差異表達基因(DEGs)。數(shù)據(jù)集GSE66957包括57 例卵巢癌標本和12例正常卵巢標本，數(shù)據(jù)集GSE14407包括12例卵巢癌標本和12例正常卵巢標本。

1.5 DEGs的篩選

利用GEO2R篩選卵巢癌中的DEGs，篩選標準為adjP<0.05和| log2FC |>1。

1.6 TG- miR4324與DEGs的交集

應用在線工具繪制文氏圖，取TG- miR4324與數(shù)據(jù)集GSE66957 DEGs、GSE14407 DEGs的交集，篩選出驗證后的miR- 4324相關性差異靶基因，并作進一步研究。

1.7 GO注釋和KEGG路徑富集分析

利用DAVID 數(shù)據(jù)庫(https:∥david.ncifcrf.gov/)對miR- 4324相關性差異靶基因進行GO功能注釋和KEGG途徑富集分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

1.8 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建與模塊選擇

利用檢索相互作用基因的搜索工具(STRING，11.0版，https:∥STRING- db.org/)數(shù)據(jù)庫[5]，基于miR- 4324相關性差異靶基因構(gòu)建蛋白質(zhì)- 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡，然后由Cytoscape軟件[6](3.7.2版)可視化，以置信度C≥0.4為截止標準。用cytoHubba插件篩選hub基因。然后用MCODE插件篩選功能模塊，篩選度閾值=2，節(jié)點數(shù)閾值=0.2，最大深度=100，K核=2的PPI網(wǎng)絡模塊。

1.9 生存分析

利用在線生存分析工具Kaplan- Meier Plotter(http:∥kmplot.com/ analysis)評估hub基因?qū)β殉舶┗颊呖偵嫫?OS)的影響。

2 結(jié) 果

2.1 miR- 4324在卵巢癌中表達下調(diào)

miR- 4324的表達是基于GEO數(shù)據(jù)庫在一系列卵巢癌和正常卵巢組織中評估的。共收集了兩個GEO數(shù)據(jù)集(GSE83693和GSE119055)。分為83693NP、83693NR、83693NC、119055組共4組。GEO2R分析顯示，與正常卵巢組織相比，各組卵巢癌中miR- 4324表達均下調(diào)(表1)。

表1 miR- 4324在不同組別中的表達

2.2 TG- miR4324的預測

利用TargetScan數(shù)據(jù)庫預測了TG- miR4324，共計5 292個靶基因。

2.3 miR- 4324相關性差異靶基因的篩選與驗證

從GSE66957和GSE14407數(shù)據(jù)集中分別篩選出5 775 和5 665個DEGs，其中上調(diào)的DEGs分別為4 487 和3 574個，然后上調(diào)的DEGs與TG- miR4324取交集，以此驗證TG- miR4324，共得到290個miR- 4324相關性差異靶基因(圖1)。

圖1 GSE66957上調(diào)的DEGs及GSE14407上調(diào)的DEGs與TG- miR4324的交集

2.4 290個miR- 4324相關性差異靶基因在卵巢癌中的功能分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對290 個差異靶基因進行GO 和KEGG富集分析。GO 分析(表2)顯示，細胞學過程(biological processes，BP) 變化主要是血管再生、血管內(nèi)皮細胞增殖、細胞外基質(zhì)、細胞黏附、遷移、胞內(nèi)循環(huán)、蛋白糖基化、蛋白類泛素化修飾、硫酸角質(zhì)素生物合成過程、RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、ARF蛋白信號轉(zhuǎn)導的調(diào)控、對肽類激素的反應、細胞命運鎖定等104個功能簇；分子功能(molecular function，MF) 變化主要是染色體結(jié)合、ATP結(jié)合、泛素蛋白轉(zhuǎn)移酶活性、細胞外基質(zhì)組織、轉(zhuǎn)錄因子活性、序列特異性DNA結(jié)合、賴氨酰氧化酶活性等93個功能簇；細胞成分(cell component，CC) 變化主要是細胞外基質(zhì)、細胞質(zhì)、細胞基膜、蛋白質(zhì)性細胞外基質(zhì)、高爾基體、初級內(nèi)含體、細胞骨架、基底膜等143個功能簇。KEGG 通路分析(表3)顯示，基因富集于細胞外基質(zhì)受體的相互作用、糖胺聚糖生物合成(硫酸角質(zhì)素)和癌癥相關通路共3條信號通路。

表2 卵巢癌中miR- 4324相關性差異靶基因GO(前10)富集分析

表3 卵巢癌中miR- 4324相關性差異靶基因KEGG通路分析

2.5 PPI網(wǎng)絡構(gòu)建與模塊選擇

290個miR- 4324相關性差異靶基因的PPI網(wǎng)絡由198個節(jié)點和330個邊緣組成(圖2)。以度≥10為截止標準[7]，得到8個hub基因(圖3)。使用MCODE從PPI網(wǎng)絡中獲得一個重要模塊，包括10個節(jié)點和45個邊緣(圖4)。

圖2 miR- 4324相關性差異靶基因的PPI網(wǎng)絡

圖3 PPI網(wǎng)絡中篩選出的hub基因

圖4 PPI網(wǎng)絡中篩選出的重要功能模塊

2.6 生存分析

根據(jù)hub基因的高表達和低表達分析卵巢癌患者的OS。結(jié)果發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者中SPSB1、ANAPC7、HECW2、TGOLN2基因高表達者及UBE2O、MCM5基因低表達者，其OS明顯縮短(圖5)。

圖5 hub基因表達與卵巢癌患者OS的K- M生存曲線

3 討 論

目前miR- 4324表達與腫瘤關系的研究逐漸成為熱點。本研究通過比較卵巢癌組織和正常卵巢組織中的miRNA表達譜，發(fā)現(xiàn)卵巢癌中miR- 4324異常表達。數(shù)據(jù)分析表明，與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中miR- 4324的表達下調(diào)，這與大多數(shù)腫瘤中miR- 4324的表達情況[3- 4,8- 10]一致。此外，我們還通過靶基因預測、篩選驗證、GO分析、KEGG途徑富集、PPI網(wǎng)絡構(gòu)建和Kaplan- Meier Plotter分析，研究miR- 4324參與卵巢癌關鍵生物學過程中可能的新型標志物和潛在治療靶點。GO分析表明，在卵巢癌中，miR- 4324相關性差異靶基因主要富集于細胞黏附、細胞遷移、血管再生、細胞外基質(zhì)、內(nèi)吞循環(huán)、泛素化修飾等功能簇。KEGG途徑注釋表明，miR- 4324相關性差異靶基因主要富集于細胞外基質(zhì)受體的相互作用、糖胺聚糖生物合成(硫酸角質(zhì)素)和癌癥相關通路共3條信號通路。PPI網(wǎng)絡的構(gòu)建及hub基因的篩選表明CDCA8、SPSB1、UBE2O、ANAPC7、MCM5、KIF4A、HECW2、TGOLN2是miR- 4324參與卵巢癌生物學過程的關鍵基因。且預后分析表明，卵巢癌患者中，SPSB1、ANAPC7、HECW2、TGOLN2基因高表達者及UBE2O、MCM5基因低表達者，OS明顯縮短。

SPSB1基因高表達和低表達患者的中位OS分別為39.87個月和45.77個月(P<0.05)。SPSB1基因(splA/ryanodine receptor domain and SOCS box containing 1 gene)位于1號染色體p36.22處，屬于細胞因子抑制物(suppressor of cytokine signaling，SOCS)家族中的Sps6亞家族成員之一。越來越多的研究[11- 14]表明，SPSB1基因參與腫瘤的生物學過程。本研究表明，miR- 4324相關性差異靶基因SPSB1作為hub基因，參與主要功能模塊的構(gòu)建，在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且其高表達與卵巢癌患者的不良預后有關。

TGOLN2基因高表達和低表達患者的中位OS分別為42個月和46.6個月(P<0.05)。TGOLN2基因編碼位于反面高爾基體網(wǎng)狀蛋白上的Ⅰ型跨膜整合蛋白，這個蛋白在胞外囊泡的形成中起重要作用。目前的研究表明包括反面高爾基體網(wǎng)在內(nèi)的高爾基復合體在自噬過程中起重要作用[15- 16]，而自噬與卵巢癌一直是研究熱點[17- 18]。許多學者認為，卵巢癌細胞中自噬活性的增強可促進其耐藥的產(chǎn)生，而抑制自噬的產(chǎn)生或降低自噬活性，或許可以提高化療藥物敏感性。本研究表明，miR- 4324相關性差異靶基因TGOLN2，可能通過調(diào)節(jié)自噬活性，從而參與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸，其基因高表達與卵巢癌患者的不良預后有關。

通過生物信息學分析和研究我們發(fā)現(xiàn)，miR- 4324在卵巢癌中表達下調(diào)，miR- 4324可能通過調(diào)控SPSB1、TGOLN2等miR- 4324相關性差異靶基因的表達，從而介導卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。