朱燕燕，馬桂娟，王鵬，湯麗華，馬雪梅

寧夏回族自治區(qū)食品檢測研究院（銀川 750001）

孔雀石綠（MG）和結(jié)晶紫（CV）均屬于人工合成的堿性三苯甲烷類工業(yè)染料，因其具有抗菌譜廣、殺菌效果好的特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖和運(yùn)輸過程中常作為殺菌劑，用于預(yù)防魚類的爛鰓病、水霉病及寄生蟲病等，以使水產(chǎn)品的存活時間延長[1-3]。CV和MG進(jìn)入魚類體內(nèi)后，大部分會迅速發(fā)生生物轉(zhuǎn)化作用而形成其還原代謝產(chǎn)物隱性結(jié)晶紫（LCV）和隱性孔雀石綠（LMG）[4]。由于CV和MG及其代謝產(chǎn)物具有高殘留、高毒性、致癌、致畸、致突變等毒副作用[5-6]。因此，歐盟、加拿大、美國及中國均已將其列入水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物[7-8]。但由于其價格低廉，對預(yù)防爛鰓病和水霉病的效果顯著，并且沒有更好的替代品出現(xiàn)，因此在魚類養(yǎng)殖中添加CV和MG的情況時有發(fā)生[9]，對消費(fèi)者的健康造成嚴(yán)重威脅。因此，對CV、MG及其代謝物的檢測方法進(jìn)行優(yōu)化，以對該類禁用藥物進(jìn)行準(zhǔn)確快速的測定，為魚類產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測提供技術(shù)支撐，具有重要意義。

目前，CV、MG及其代謝物殘留量的檢測手段主要有膠體金免疫分析法[10]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[11-12]、高效液相色譜法（HPLC）[13-14]、熒光光譜法[15]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）[16-19]等。其中，具有較高靈敏度的HPLC-MS/MS應(yīng)用最為廣泛。但現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法GB/T 19857—2005《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》前處理較為復(fù)雜，耗費(fèi)時間過長，不能滿足目標(biāo)物因具有不穩(wěn)定性而需要快速處理上機(jī)的要求。采用HPLC-MS/MS法，通過對樣品的前處理過程和儀器條件進(jìn)行優(yōu)化，有效降低前處理過程中的損失，建立以氘代內(nèi)標(biāo)法定量同時測定魚肉中CV、MG及其代謝物殘留的檢測方法，并做出方法學(xué)論證，以期為監(jiān)控魚肉中的CV、MG及其代謝物提供一定的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1290/6460高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國Agilent公司）；3-15高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；渦旋混勻儀（上海五相儀器儀表公司）；分析天平（BT25S型，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；超聲機(jī)（B2200S-7，上海必能信超聲有限公司）；氮吹儀（EVA50A，北京普利泰科有限公司）；IKA T25數(shù)顯型分散機(jī)（德國IKA公司）。

孔雀石綠、隱性孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫、孔雀石綠-D5、隱性孔雀石綠-D6標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

乙腈、甲醇（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；硝酸（分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無水乙酸銨（色譜級，德國Sigma公司）；中性氧化鋁柱（3 mL，500 mg，美國Waters公司）；試驗用水（超純水，由美國Milli-Q超純水系統(tǒng)純化）；0.22 μm微孔濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）；草魚、鯉魚、鯽魚、鱸魚（日常監(jiān)督抽檢及銀川市售）。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配制

分別精密稱取MG，CV，LMG，LCV，MG-D5和LMG-D6標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，得到1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，于-18 ℃避光保存3個月。分別吸取MG，CV，LMG和LCV的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液各1 mL于100 mL棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，制得10.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。同法制得MG-D5和LMG-D6的100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合內(nèi)標(biāo)溶液。取陰性魚肉樣品按1.2.2進(jìn)行前處理，制得空白基質(zhì)溶液，配制成質(zhì)量濃度分別為0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0和20.0 ng/mL的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（其中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為5.0 ng/mL）。

1.2.2 樣品前處理

1.2.2.1 樣品制備

將新鮮魚樣品去皮，取可食用部分，用IKA T25數(shù)顯型分散機(jī)均質(zhì)成肉糜，備用。

1.2.2.2 提取

準(zhǔn)確稱取5.0 g魚肉試樣于50.0 mL具塞離心管中，加入500 μL 100.0 ng/mL混合內(nèi)標(biāo)溶液，然后加入10 mL乙腈，渦旋2 min，超聲振蕩提取15 min，按8000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至25.0 mL容量瓶中，殘渣再用10 mL乙腈重復(fù)重復(fù)提取一次，上清液合并轉(zhuǎn)移至同一容量瓶中，并用乙腈定容，待凈化。

1.2.2.3 凈化

先用5 mL乙腈對中性氧化鋁固相萃取柱進(jìn)行活化，準(zhǔn)確移取5 mL待凈化液加入SPE小柱凈化，然后用5 mL乙腈淋洗，上樣即用雞心瓶接收流出液。于45℃旋蒸近干，初始流動相復(fù)溶至2.0 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，上機(jī)待測。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18，2.1 mm（內(nèi)徑）×100 mm，粒徑3.5 μm；柱溫：25 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；運(yùn)行時間：10 min；流動相A：含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨水溶液；流動相B：乙腈；梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫程序

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI+）；離子源溫度：350 ℃；干燥氣流速：8.0 L/min；鞘氣溫度：400 ℃；鞘氣流速：12.0 L/min；霧化器壓力：45 psi；噴嘴電壓：500 V；毛細(xì)管電壓：3.5 kV（ESI+）；碰撞氣：純度為99.999%的高純氮?dú)猓徊捎枚喾磻?yīng)監(jiān)測（MRM）模式掃描。4種目標(biāo)物及其內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別移取1.0 μg/mL的MG，LMG，CV，LCV，MG-D5和LMG-D6單標(biāo)溶液，將液相色譜和質(zhì)譜間通過二通連接，通過針泵進(jìn)樣注入電噴霧離子源，在正離子模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜全掃描，并優(yōu)化毛細(xì)管出口電壓，得到響應(yīng)最優(yōu)的準(zhǔn)分子離子峰。再對準(zhǔn)分子離子分別進(jìn)行子離子掃描，選取響應(yīng)最高、干擾最小的兩個特征碎片離子分別作為各目標(biāo)物的定量和定性離子，并對離子源溫度、碰撞能、碎裂電壓、霧化器壓力等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以使離子對的響應(yīng)最佳。最終確定各目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)見表2。

鑒于歐盟（2002/657/EC）指令[20]規(guī)定：禁用藥物的質(zhì)譜確證方法需要有4個確證點(diǎn)。試驗中，4種目標(biāo)物MG、LMG、CV和LCV分別選定1個準(zhǔn)分子離子和2個特征離子作為監(jiān)測離子對，MG-D5作為MG和CV的內(nèi)標(biāo)，而LMG-D6作為LMG和LCV的內(nèi)標(biāo)，以多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）對目標(biāo)物進(jìn)行定性定量分析。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗在正離子模式下，以反相Agilent ZORBAX Eclipse plus C18作為分離色譜柱，分別研究了以甲醇溶液和乙腈溶液作為有機(jī)相時目標(biāo)物的分離情況，結(jié)果顯示乙腈溶液具有更優(yōu)的分離度及更高的靈敏度，因此試驗選定乙腈溶液作為有機(jī)相。鑒于弱酸性流動相會促進(jìn)電噴霧正離子模式下的離子化效率，且乙酸銨等也會對離子化起到一定促進(jìn)作用，試驗考察了分別以含0.05%甲酸的5 mmol/L乙酸銨、含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨、含0.2%甲酸的5 mmol/L乙酸銨、含0.2%甲酸的10 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相時各目標(biāo)物的響應(yīng)及峰型。結(jié)果顯示，以含0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相時，4種目標(biāo)物均具有更高的響應(yīng)及更優(yōu)的峰型。因此，將其確定為流動相，并對流動相的梯度進(jìn)行優(yōu)化，梯度洗脫程序見表1。在優(yōu)化的色譜及質(zhì)譜條件下，4種目標(biāo)物的保留時間在2.60～5.16 min之間，標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM色譜圖見圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.3.1 提取條件優(yōu)化

CV和MG易轉(zhuǎn)化為LCV與LMG，并且在光照及高溫等條件下易發(fā)生氧化降解和甲基化等反應(yīng)，這種特性為標(biāo)準(zhǔn)儲備液的貯存和目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量增加了一定難度，因此在避光條件下進(jìn)行該試驗。

魚肉的化學(xué)成分較為復(fù)雜，蛋白質(zhì)含量較高，并且MG和CV在魚肉中主要以其隱性代謝物L(fēng)MG和LCV的形式存在。鑒于LMG和LCV的極性較弱，具有良好的親脂性，易溶于有機(jī)溶劑。試驗分別比較了甲醇和乙腈兩種提取液，結(jié)果表明甲醇提取液較為渾濁、干擾成分較多，不利于過SPE柱凈化，而乙腈因具有沉淀蛋白的作用，且回收率較高，具有更好的提取效果。因此，試驗將乙腈作為提取溶劑。

2.3.2 提取體積的優(yōu)化

試驗分別考察了以10，15，20和25 mL乙腈作為提取液分兩次提取，分別超聲15 min時，4種目標(biāo)物的回收率。結(jié)果表明隨乙腈體積的增大，目標(biāo)物的回收率逐漸提高，但當(dāng)提取液的體積達(dá)到20 mL后，再增加提取液用量，對目標(biāo)物的回收率基本沒有影響。因此，試驗采用20 mL乙腈作為提取溶液。

2.3.3 提取時間優(yōu)化

試驗以20 mL乙腈作為提取液，比較了提取時間分別為5，10，15和20 min時，4種目標(biāo)物的回收率。結(jié)果顯示：隨提取時間的增加，目標(biāo)物的回收率逐漸增高，但當(dāng)提取時間達(dá)到15 min后再增加提取時間，目標(biāo)物的回收率變化不大。因此，試驗選擇以15 min作為超聲提取時間。

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

采用HPLC-MS/MS法測定獸藥殘留時，由于目標(biāo)物、流動相和樣液中的共提取物同時進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)，影響目標(biāo)物的離子化過程，使目標(biāo)物的響應(yīng)增強(qiáng)或者減弱，并對目標(biāo)物的準(zhǔn)確定量造成影響，即存在基質(zhì)效應(yīng)。因此，為消除基質(zhì)效應(yīng)的干擾，本試驗采用陰性魚肉樣品的提取液配制標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。將0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0和20.0 μg/L的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按照試驗方法進(jìn)行測定，以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)化合物與其內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值作為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，采用內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果表明，在0.1～20.0 μg/L范圍內(nèi)，MG、CV、LMG、LCV的濃度與峰面積均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。4種目標(biāo)物的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限（信噪比S/N≥3）、定量限（信噪比S/N≥10）見表3。

表3 線性方程，相關(guān)系數(shù)，線性范圍、檢出限和定量限

2.5 方法的回收率和精密度試驗

以陰性魚肉樣品作為空白基質(zhì)，分別進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5，1.0和4.0 μg/kg的三個水平的加標(biāo)回收試驗，每個水平重復(fù)測定6次（n=6），計算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）。4種目標(biāo)物的平均回收率范圍為85.6%～110.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～7.6%，方法的準(zhǔn)確度和精密度符合方法學(xué)要求，具有可行性。4種目標(biāo)物的平均回收率及其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果，詳見表4。

表4 方法的平均回收率及精密度試驗（n=6）

2.6 實際樣品的測定

采用該方法對日常監(jiān)督抽檢及銀川市售的40批次魚類樣品進(jìn)行檢測，未在樣品中檢出孔雀石綠和結(jié)晶紫及其代謝物，符合中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號[8]規(guī)定。

3 結(jié)論

在避光條件下，采用乙腈溶液直接提取，中性氧化鋁SPE柱凈化，結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)，建立同時測定魚肉中MG、LV及其代謝物的檢測方法，并進(jìn)行方法學(xué)論證。該方法具有前處理過程簡單快速、結(jié)果可靠、適用性強(qiáng)、重現(xiàn)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，有效解決了目標(biāo)物穩(wěn)定性較差，需要較快處理的要求，可以為日常監(jiān)督抽檢過程中目標(biāo)物的定性篩查和定量檢測提供技術(shù)支撐。