莊坤，劉凱，孫威，胥偉

1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（武漢 430023）；2.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)六師五家渠市食品藥品檢驗(yàn)所（五家渠 830013）

硒元素作為人體必需的14種微量元素之一[1]，在人體健康中起到抗氧化、抗病毒感染、預(yù)防癌癥、提免疫力、重金屬解毒、維持正常生殖功能等作用[2]。在中國低硒地區(qū)攝入的硒元素缺失會引起2種典型疾病——克山?。ǖ胤叫孕募〔。⒋蠊枪?jié)?。ㄗ冃侮P(guān)節(jié)炎）[3]。有資料顯示調(diào)查中國13個省市成年人平均每日硒攝入量為26.63 μg，低硒區(qū)人群僅為3～11 μg[4]，遠(yuǎn)低于世界衛(wèi)生組織推薦的50 μg的標(biāo)準(zhǔn)[5]，中國將富硒食品作為營養(yǎng)補(bǔ)充的重要方式，因此不同富硒食品體系中硒含量檢測方法的專用性研究顯得尤為重要?？偽康臋z測方法很多，主要包括比色法、熒光分光光度法[6]、氫化物-原子熒光法[7]、火焰原子吸收法[8]、催化動力學(xué)光度法、高效液相色譜法[9]和電感耦合等離子體質(zhì)譜法[10]等。氫化物-原子熒光光譜法由于具有靈敏度高、干擾少、儀器操作簡單等諸多特點(diǎn)[11]，是較為普及的總硒含量測定方法[12]。市面上富硒食品種類繁多，各類食品在樣品消解和預(yù)還原等方面效果大相徑庭，籠統(tǒng)的檢測方法會導(dǎo)致結(jié)果的明顯差別。因此，試驗(yàn)針對富硒雞肉產(chǎn)品的樣品特點(diǎn)，重點(diǎn)研究樣品前處理、預(yù)還原方法、試劑體系等方面對雞肉產(chǎn)品總硒含量檢測結(jié)果的影響，建立一種既準(zhǔn)確又穩(wěn)定的測定雞肉產(chǎn)品中總硒含量的氫化物-原子熒光光譜法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

富硒雞肉（由市場采購，各種雞肉樣品經(jīng)過清洗去皮去骨后，由均質(zhì)機(jī)攪拌至肉泥狀，用自封袋包裝后放入冰箱冷藏待用）。

鹽酸、硝酸（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)）；氫氧化鉀、鐵氰化鉀、硼氫化鉀（分析純，國藥集團(tuán)）；硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（1000 mg/L，國家有色金屬及電子材料分析測試中心）。

1.2 儀器與設(shè)備

SK2003AZ原子熒光光譜儀（北京金索坤技術(shù)開發(fā)有限公司）；Milli-Q Integral超純水機(jī)（美國Millipore公司）；HS-26恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；DB-3EFS電熱板（陜西海聯(lián)化玻儀器化工有限公司）；Multiwave PRO微波消解儀（美國CEM公司）。

原子熒光光譜儀工作參數(shù)：負(fù)高壓300 V；燈電流80 mA；積分時間5 s；主氣流量600 mL/min；輔氣流量800 mL/min；測量方式標(biāo)準(zhǔn)曲線法；延遲時間3 s。

1.3 方法

1.3.1 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

取10 mL硒標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1000 mg/L）定容于100 mL容量瓶中，制備成硒標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 mg/L）；取1 mL硒標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 mg/L）定容于100 mL容量，制備成硒標(biāo)準(zhǔn)使用液（1 mg/L）；準(zhǔn)確量取0，1.0，2.0，5.0和10.0 mL標(biāo)準(zhǔn)硒標(biāo)準(zhǔn)使用液分別定容于100 mL容量瓶中，混合均勻，配制質(zhì)量濃度0，1.0，2.0，5.0和10.0 μg/L的系列硒標(biāo)準(zhǔn)溶液，標(biāo)準(zhǔn)溶液均采用介質(zhì)酸定容。

1.3.2 介質(zhì)酸及還原劑的濃度研究

在固定還原劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%硼氫化鉀（KBH4）+0.5%氫氧化鉀（KOH）情況下，分別使用體積分?jǐn)?shù)5%，7%，9%，10%，11%和13%的HCl作為介質(zhì)酸，考察HCl濃度對硒元素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響。

在固定介質(zhì)酸中HCl體積分?jǐn)?shù)10%，還原劑中KOH濃度0.5%情況下，分別將還原劑中KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)定為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%，考察KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對熒光強(qiáng)度的影響。

試驗(yàn)均采用5 μg/L硒標(biāo)準(zhǔn)溶液作為檢測熒光強(qiáng)度的樣品。

1.3.3 消解方式及消解液配比的比較

精確稱取0.5000±0.0001 g雞胸肉樣品，分別使用濕法消解和微波消解兩種方式，對比在相同的消解液體系中2種消解方式對樣品消解效果的影響?？紤]到儀器設(shè)備使用要求和雞肉樣品特性，選擇硝酸（HNO3）-過氧化氫（H2O2）的消解酸體系，在消解酸總體積恒定為12 mL的情況下，探討HNO3∶H2O2質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度（5∶1，3∶1，2∶1，7∶5和1∶1）對雞肉樣品消解效果的影響。

1.3.4 預(yù)還原方法的比較

在預(yù)還原部分設(shè)計3種試驗(yàn)方法，分別為：HCl（6 mol/L）電熱板法，在消解殘夜中加入5 mL HCl（6 mol/L）電熱板加熱100 ℃預(yù)還原至溶液約1 mL；濃HCl電熱板法，在消解殘夜中加入5 mL濃HCl電熱板加熱100 ℃預(yù)還原至溶液約1 mL；沸水浴還原法，待消解殘液冷卻后，加入30 mL 10% HCl，用保鮮膜封口水浴20 min。

該部分試驗(yàn)需要精確稱取0.5000±0.0001 g雞胸肉，同時消解以后分別按照上述3種預(yù)還原方法進(jìn)行試驗(yàn)檢測各樣品熒光強(qiáng)度，考察每種預(yù)還原方法對樣品熒光強(qiáng)度的影響。

1.3.5 沸水浴還原方法的條件優(yōu)化

對沸水浴還原法中加入HCl溶液濃度、沸水浴時間和HCl溶液添加體積3個條件進(jìn)行優(yōu)化，3個條件設(shè)計梯度依次為HCl溶液體積分?jǐn)?shù)（8%，10%，12%，14%和16%），沸水浴時間（10，15，20，25和30 min），HCl溶液添加體積（10，15，20，25和30 mL）。

1.3.6 精密度及回收率試驗(yàn)

精密度試驗(yàn)使用相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）表示，其代表測量的重現(xiàn)性且是試驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確的重要條件。按照優(yōu)化的試驗(yàn)條件對4種雞肉產(chǎn)品分別進(jìn)行6次重復(fù)的檢測，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD），探討優(yōu)化后試驗(yàn)方法的精密度。

根據(jù)4種富硒雞肉產(chǎn)品檢測出的硒含量結(jié)果，分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（雞肉干500 μg/kg、雞腿肉200 μg/kg、雞胸肉100 μg/kg、雞翅肉30 μg/kg）進(jìn)行加標(biāo)回收率檢測。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對每組試驗(yàn)的6次重復(fù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定方差是否具有統(tǒng)計學(xué)上的同質(zhì)性，結(jié)果用均數(shù)±SRSD表示，繪圖使用Microsoft Excel 2007軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 介質(zhì)酸及還原劑的濃度研究

根據(jù)GB 5009.93—2017中第一法氫化物原子熒光光譜法要求，以及所用原子熒光光譜儀自身設(shè)備的要求，在檢測硒元素時，選擇一定體積比濃度的HCl作為硒元素溶解的介質(zhì)酸，選擇KBH4-KOH混合溶液作為氫化反應(yīng)的還原劑，其中KBH4是將Se還原并生成H2Se的還原劑，因此在配制介質(zhì)酸和還原劑時，其濃度對檢測的熒光強(qiáng)度有顯著影響。

2.1.1 HCl介質(zhì)酸濃度的選擇

由圖1可以看出：介質(zhì)酸中HCl體積分?jǐn)?shù)的提高對硒元素?zé)晒鈴?qiáng)度在一定范圍內(nèi)有提升作用，HCl體積分?jǐn)?shù)達(dá)到9%時，硒元素?zé)晒鈴?qiáng)度的上升趨勢明顯減緩，但HCl體積分?jǐn)?shù)大于10%，硒元素的熒光強(qiáng)度基本維持在910左右，總體趨于穩(wěn)定，故介質(zhì)酸中HCl體積分?jǐn)?shù)應(yīng)≥10%。

圖1 HCl體積分?jǐn)?shù)對硒元素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，介質(zhì)酸中HCl及還原劑中KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對硒元素?zé)晒鈴?qiáng)度影響明顯，在茍體忠[13]、胡婷[14]等研究發(fā)現(xiàn)，介質(zhì)酸中HCl體積分?jǐn)?shù)過高或過低對硒元素的熒光強(qiáng)度均造成減弱影響，而在試驗(yàn)中，HCl體積分?jǐn)?shù)在10%～13%區(qū)間中硒元素?zé)晒鈴?qiáng)度趨于穩(wěn)定不變，這與劉恒等[15]的研究結(jié)果相似，推測可能是由于HCl體積分?jǐn)?shù)最高僅13%，未達(dá)到減弱熒光強(qiáng)度的拐點(diǎn)值，因此介質(zhì)酸中HCl體積分?jǐn)?shù)應(yīng)在10%～13%。

2.1.2 還原劑中KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

觀察圖2中數(shù)據(jù)變化可以發(fā)現(xiàn)，硒元素的熒光強(qiáng)度隨著KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)提升呈現(xiàn)先增加后減少變化趨勢，其中KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.5%～1.5%，硒元素?zé)晒鈴?qiáng)度呈現(xiàn)迅速上升，KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1.5%～3.0%區(qū)間，硒元素?zé)晒鈴?qiáng)度逐漸出現(xiàn)下降，KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%時熒光強(qiáng)度為最高值929.0，后續(xù)試驗(yàn)選擇還原劑中KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%。

圖2 硼氫化鉀濃度對硒元素?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

還原劑中KBH4在介質(zhì)酸中與Se4+反應(yīng)生成H2Se，原子化后在硒元素空心陰極燈照射下發(fā)生特定波長的熒光，因此還原劑中KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)會顯著影響檢測到的熒光強(qiáng)度[16]。KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%時熒光強(qiáng)度升至最高點(diǎn)，KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1.5%后熒光強(qiáng)度出現(xiàn)下降，故選擇1.5%作為還原劑中KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)。陳曉霞等[17]在研究中分析原因是KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時Se原子氫化反應(yīng)不完全，檢測到的熒光強(qiáng)度弱；KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時氫化反應(yīng)過于劇烈，不但產(chǎn)生過量氫氣稀釋Se原子蒸汽，同時造成原子化器火焰增強(qiáng)，增加設(shè)備噪聲，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

結(jié)合GB 5009.93—2017[18]和一般富硒雞肉產(chǎn)品硒元素含量，選擇0，1，2，5和10 μg/L 5個質(zhì)量濃度點(diǎn)制作硒元素標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖3可以看出：R2為0.99948，說明在硒元素質(zhì)量濃度小于10.0 μg/L區(qū)間內(nèi)與儀器所測熒光強(qiáng)度值的線性擬合關(guān)系較好，該批次硒元素檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=154.55x+180.92。

圖3 硒元素標(biāo)準(zhǔn)曲

2.3 不同消解方式及消解液配比的比較研究

使用濕法消解和微波消解2種方式，分別按照試驗(yàn)設(shè)計的HNO3與H2O2體積比進(jìn)行消解驗(yàn)證試驗(yàn)。從圖4可以看出，在恒定為12 mL的消解液中，隨著H2O2在體系中占比增加，濕法消解樣品的熒光強(qiáng)度總體呈現(xiàn)先增后減趨勢，而微波消解樣品的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的變化趨勢。HNO3與H2O2體積比7∶5時，濕法消解的熒光強(qiáng)度達(dá)到高值拐點(diǎn)329.8，是5組樣品中熒光強(qiáng)度最高值，而微波消解方式在該體積比條件下熒光強(qiáng)度（340.6）與體積比1∶1時熒光強(qiáng)度（342.5）無顯著差異。在相同比例的條件下，微波消解的熒光強(qiáng)度總體上要比濕法消解高一些。結(jié)果表明，在雞肉消解過程中，無論是濕法消解還是微波消解，選擇HNO3與H2O2體積比7∶5作為消解酸的最適配比，如果條件允許，優(yōu)先選擇微波消解方法。

圖4 不同消解方式及消解液配比對樣品熒光強(qiáng)度的影響

在元素含量檢測中樣品的消解方式很多，但GB 5009.93—2017[13]中僅對濕法消解和微波消解進(jìn)行詳細(xì)說明，試驗(yàn)對2種消解方式進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)無論是濕法消解還是微波消解，選擇HNO3與H2O2體積比7∶5作為消解液的最適配比。在相同比例的條件下，微波消解的熒光強(qiáng)度總體上要比濕法消解高一些，這是由于在濕法消解過程中，一方面由于H2O2加熱后產(chǎn)品大量泡沫會黏在錐形瓶玻璃壁，造成樣品損失[19]，另一方面電熱板溫度控制不規(guī)范時，造成加熱過程中形成氫化物逸出[20]。因此如果條件允許，優(yōu)先選擇微波消解方法。

2.4 預(yù)還原方法的比較及條件優(yōu)化研究

2.4.1 預(yù)還原方法的比較

對比表1中3種預(yù)還原方法所測雞胸肉的熒光強(qiáng)度結(jié)果具有一定差異性，濃HCl電熱板法所測樣品的熒光強(qiáng)度最低，且所測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差較大；HCl（6 mol/L）電熱板法與沸水浴還原法所測熒光強(qiáng)度差異微弱（p＜0.05），但沸水浴還原法檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差較小，說明使用沸水浴加熱的預(yù)還原方法能夠更完全地將雞肉消解液中的Se6+還原成Se4+，并且檢測組別間的數(shù)據(jù)穩(wěn)定性更好。

表1 預(yù)還原方法的比較

樣品在經(jīng)過消解后硒元素被氧化為Se6+，但Se6+無法直接與KBH4反應(yīng)生成H2Se，還需要利用HCl溶液對消解液進(jìn)行預(yù)還原處理，將Se6+還原成Se4+以便后續(xù)氫化反應(yīng)。由于硒元素易揮發(fā)，在還原過程中加熱溫度過高會造成硒元素?fù)]發(fā)損失[21]，因此試驗(yàn)中設(shè)計的3種預(yù)還原方法的加熱溫度均在100 ℃，結(jié)果表明，濃HCl電熱板法所測結(jié)果最低，而沸水浴還原法和HCl（6 mol/L）電熱板加熱法的檢測結(jié)果較好且相近，但沸水浴還原法檢測結(jié)果的穩(wěn)定性更強(qiáng)。這可能是由于電熱板加熱在排煙過程中硒元素可能會形成揮發(fā)性的氯化物而損失[22]，濃HCl造成預(yù)還原過程中用酸濃度太高容易伴生干擾離子，從而影響硒含量的測試結(jié)果[23]。

2.4.2 沸水浴預(yù)還原法條件的優(yōu)化

由圖5可以發(fā)現(xiàn)：HCl體積分?jǐn)?shù)達(dá)到12%后，硒元素的檢測結(jié)果才達(dá)到穩(wěn)定；添加25 mL HCl溶液時硒元素的檢測結(jié)果趨于穩(wěn)定；預(yù)還原在沸水浴20 min之后樣品檢測的硒元素結(jié)果趨于穩(wěn)定。因此，沸水浴還原法經(jīng)過優(yōu)化后條件為：選擇添加25 mL 12%的HCl溶液沸水浴20 min。

圖5 HCl體積分?jǐn)?shù)、添加體積和沸水浴時間對樣品硒含量檢測結(jié)果的影響

在沸水浴還原法中HCl體積分?jǐn)?shù)、添加量和水浴時間都是影響Se6+能否完全被還原成Se4+的重要因素，經(jīng)過單因素試驗(yàn)之后發(fā)現(xiàn)最優(yōu)沸水浴還原法條件為：添加25 mL 12%的HCl溶液沸水浴20 min。綜合2.1.1介質(zhì)酸中HCl體積分?jǐn)?shù)選擇結(jié)果，HCl體積分?jǐn)?shù)10%～13%時中硒元素?zé)晒鈴?qiáng)度穩(wěn)定，考慮到減少預(yù)還原中HCl體積分?jǐn)?shù)與介質(zhì)酸中HCl體積分?jǐn)?shù)不同對總硒含量檢測結(jié)果的影響，因此，確定介質(zhì)酸中HCl體積分?jǐn)?shù)為12%。

2.5 富硒雞肉產(chǎn)品檢測結(jié)果、精密度及回收率

由表2中所測數(shù)據(jù)可以看出，雞肉干樣品的總硒含量最高，達(dá)到474.55 μg/kg，雞翅肉的硒含量最少，只有26.77 μg/kg，雞腿肉和雞胸肉分別為159.97 μg/kg和183.35 μg/kg。4種富硒雞肉樣品按照上述優(yōu)化后的方法分別進(jìn)行6組試驗(yàn)，4種樣品所測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差依次為1.29%，0.89%，1.53%和1.21%（n=6），均小于5%，說明該方法對雞肉產(chǎn)品總硒含量的檢測精密度較高[24]。根據(jù)4種富硒雞肉樣品總硒含量檢測結(jié)果分別加入不同濃度的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測，該檢測方法回收率分別為99.25%，103.01%，101.46%和104.76%。

表2 富硒雞肉樣品中硒含量檢測結(jié)果（n=6）

經(jīng)過方法改進(jìn)優(yōu)化后，4種富硒雞肉產(chǎn)品檢測得到的總硒含量在26.77～474.55 μg/kg，SRSD為0.89%～1.53%，回收率為99.25%～104.76%，說明該方法用于檢測雞肉中總硒含量的精密度和回收率都較好。

美國國家科學(xué)院食物營養(yǎng)學(xué)會在1989年推薦硒的膳食供給量中成年男性為70 μg/d，女性為55 μg/d[25]，2000年中國營養(yǎng)學(xué)會制定的《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》中推薦的承認(rèn)硒攝入量為50 μg/d，成人最高可耐受硒攝入量為450 μg/d[26]。陜西地方標(biāo)準(zhǔn)（DB61/T 557.15—2012）中富硒雞肉產(chǎn)品硒含量要求為0.02～0.50 mg/kg[27]，說明硒含量小于20 μg/kg的屬于非富硒雞肉產(chǎn)品，硒含量高于500 μg/kg的屬于硒含量超標(biāo)雞肉產(chǎn)品，過度食用會引起硒中毒。4種富硒雞肉產(chǎn)品的總硒含量符合陜西地方標(biāo)準(zhǔn)要求范圍，其中雞肉干（474.55 μg/kg）硒含量雖然超過中國營養(yǎng)學(xué)會要求的最高耐受硒攝入量（450 μg/kg），但考慮到中國大部分地區(qū)缺硒，只要不長期食用該雞肉干產(chǎn)品，不會對人體健康造成較大影響[28]。

3 結(jié)論

通過對溶液配制、消解處理和預(yù)還原處理等方面試驗(yàn)條件的優(yōu)化研究，建立適合檢測富硒雞肉產(chǎn)品中總硒含量的氫化物-原子熒光光譜法。在GB 5009.93—2017相關(guān)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化比較發(fā)現(xiàn)，濕法消解和微波消解中選擇7∶5混合酸（HNO3∶H2O2）的效果最佳，相同條件下微波消解效果最好；介質(zhì)溶液選擇體積分?jǐn)?shù)12%的HCl，還原劑溶液中KBH4質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%；預(yù)還原時沸水浴還原法效果好，檢測穩(wěn)定性高，最優(yōu)條件為12%的HCl添加25 mL后沸水浴20 min。

利用上述條件檢測出4種富硒雞肉產(chǎn)品的總硒含量分別為雞肉干474.55 μg/kg、雞翅肉26.77 μg/kg、雞腿肉159.97 μg/kg、雞胸肉183.35 μg/kg。SRSD為0.89%～1.53%，回收率為99.25%～104.76%，說明該方法對雞肉產(chǎn)品中硒含量的檢測精密度高、回收率高、檢測穩(wěn)定。