吳益春 ，陳璐，郭海波*，羅海軍，王曉煜，周勇

1.舟山市食品藥品檢驗檢測研究院（舟山 316013）；2.寧波大學食品與藥學學院（寧波 315800）；3.浙江海洋大學食品與藥學學院（舟山 316022）

近年來，隨著人們對水產(chǎn)品需求的不斷擴大，為增加養(yǎng)殖產(chǎn)量、提高經(jīng)濟效益，各類獸藥被廣泛應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)。由于獸藥在使用過程中存在濫用、誤用及不遵守休藥期等現(xiàn)象，水產(chǎn)品中存在藥物殘留的現(xiàn)象較為普遍。這些有獸藥殘留的水產(chǎn)品，經(jīng)食用后在人體中蓄積，可能會產(chǎn)生致畸、致癌的嚴重危害。測定獸藥殘留及其代謝物的檢測方法有氣相色譜-質(zhì)譜法[1-2]、高效液相色譜法[3]、高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法[4-8]、超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法[9-10]、三重四極桿復合線性離子阱質(zhì)譜法[11-12]、超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法[13-14]等，由于不同獸藥的理化性質(zhì)存在較大差異，且同一種獸藥還有同系物、異構(gòu)體、降解產(chǎn)物及共軛物的存在，獸藥殘留檢測主要以分類檢測為主[9]，尚無分析方法可以同時涵蓋所有的藥物種類。試驗針對蝦肉中的大環(huán)內(nèi)酯類、酰胺醇類、硝基咪唑類、磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類等6個大類52種獸藥殘留，開發(fā)QuEChERS EMR-Lipid結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，為大批量蝦類獸藥殘留的篩查分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮淡水蝦、海水蝦（各40批，隨機采集于浙江舟山市菜市場、農(nóng)貿(mào)市場、超市）；乙腈、甲酸（色譜純，德國Merck公司）；去離子水Sartourius系統(tǒng)純凈水、十八烷基鍵合硅膠（C18）、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、0.22 μm有機針式濾膜、增強去脂萃取鹽包（m無水MgSO4∶mNaCl=4∶1）、增強型去脂分散凈化管（EMR-Lipid dSPE管，1 g，15 mL）：上海安譜科技股份有限公司；紅霉素等52種獸藥（純度均≥90.0%，標準品，德國Dr.Ehrenstorfer公司）。

1290-6470超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；5804R冷凍離心機（德國艾本德公司）；MS-3渦旋振蕩器（德國IKA公司）；UV-R超純水機（法國Millipore公司）；MS205DU電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；KQ-6000DV數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；N-EVAPTM111氮吹儀（美國Organomation公司）。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜柱ZORBAX Eclipse plus C18柱（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）；柱溫30 ℃；進樣量5 μL；流動相A為0.2%甲酸水溶液、流動相B為乙腈溶液（含0.2%甲酸）；流速0.5 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.5 min，2% B；0.5～1.8 min，2%～15% B；1.8～3.5 min，15%～20% B；3.5～6.0 min，20%～25% B；6.0～7.0 min，25%～30% B；7.0～11.0 min，30%～35% B；11.0～16.0 min，35%～100% B；16.0～26.0 min，100% B。

離子源，電噴霧離子源；掃描方式，正負離子切換掃描；檢測方式，多反應監(jiān)測（MRM）模式檢測；毛細管電壓正離子4500 V，負離子3500 V；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流量5 L/min；霧化氣壓力45 psi；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流速11 L/min；噴嘴電壓500 V，其他質(zhì)譜條件見表1。

表1 代表性化合物質(zhì)譜參數(shù)

1.3 標準溶液的配制

準確稱取適量標準品，置于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈分別溶解并定容至刻度，配制成100 mg/L的標準儲備溶液，在-18 ℃下避光保存?zhèn)溆?。混合標準溶液：分別取上述標準儲備溶液，用乙腈配制成1 mg/L的混合標準溶液，在2～4 ℃冰箱保存。

配制基質(zhì)匹配混合標準溶液。取若干空白試樣，按1.4的方法處理與凈化，用該空白試樣溶液和混合標準溶液配制成質(zhì)量濃度2～500 ng/mL基質(zhì)匹配的混合標準系列溶液。該系列溶液臨用現(xiàn)配。

1.4 樣品前處理

準確稱取2.0 g（精確至0.01 g）均質(zhì)后的試樣置于50 mL聚丙烯離心管中，加入2 mL超純水，加蓋旋渦混勻1 min后，加入8 mL 1%甲酸乙腈，加入增強去脂萃取鹽包，渦漩混勻1 min，超聲提取30 min，按6000 r/min離心5 min，取上清液，待凈化。取2 mL上清液移入QuEChERS EMR-Lipid dSPE管中，渦漩混勻1 min，靜置5 min，按6000 r/min離心5 min后，將上清液移入15 mL離心管中，于50 ℃水浴氮氣吹干，加入1 mL 20%乙腈溶液復溶，旋渦混勻30 s，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，供UPLC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

優(yōu)化碎裂電壓、碰撞能量等儀器條件設置，篩選高響應特異離子對等質(zhì)譜條件，采用正負離子掃描多反應監(jiān)測模式，一針進樣完成所有目標物的檢測。各代表性化合物質(zhì)譜參數(shù)見表1，6種代表化合物的MRM色譜圖見圖1。

圖1 每類獸藥代表性化合物在多反應監(jiān)測模式下的色譜圖

2.2 樣品前處理條件優(yōu)化

2.2.1 提取條件優(yōu)化

選擇南美白對蝦為試驗對象，通過添加回收試驗，考察甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮4種試劑的提取效率。試驗結(jié)果表明，乙酸乙酯和丙酮對蝦肉中的雜質(zhì)萃取較多，影響獸藥殘留回收率，平均回收率均低于50%。選取甲醇和乙腈2種有機溶劑進行考察，結(jié)果顯示乙腈對多數(shù)目標物均有較好的溶解性和較高的提取率[15-16]，各種獸藥平均回收率為89.4%，優(yōu)于甲醇。因此，試驗選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 凈化條件優(yōu)化

由于蝦肉中干擾物主要是脂肪、蛋白質(zhì)、色素等，為有效去除干擾物質(zhì)，考察常用凈化材料C18、PSA、增強型去脂分散凈化管對于待測目標物含量的影響。結(jié)果表明，PSA對樣品中一些強極性雜質(zhì)、脂肪酸、色素等具有良好的凈化效果，但PSA吸附磺胺類藥物，磺胺類藥物回收率最低，僅34.0%，C18粉對樣品中蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)有一定吸附效果[17]，但凈化效果不夠理想，個別樣品存在凈化后溶液較為渾濁現(xiàn)象。增強型去脂分散凈化材料能減少脂質(zhì)基質(zhì)對獸藥的吸附干擾，各種獸藥殘留最低回收率能夠達到60%以上，而且凈化后的液體不存在渾濁現(xiàn)象。因此，最終選擇增強型去脂分散凈化管作為凈化劑。

2.3 線性范圍、檢出限與定量限

采用基質(zhì)匹配標準曲線進行定量，以抵消基質(zhì)效應的影響，以目標物的峰面積為縱坐標（y），以相應的質(zhì)量濃度質(zhì)量（μg/L）為橫坐標（x）繪制標準曲線。試驗結(jié)果表明，各目標物線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.99，線性范圍較寬。以3倍信噪比（S/N）計算檢出限，各種獸藥檢出為0.36～14.00 μg/kg，結(jié)果見表2。

表2 52種獸藥的線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、檢出限、定量限、加標回收率和精密度

2.4 方法回收率與精密度

在空白南美白對蝦中分別添加低、中、高3個水平的混合標準溶液，每個添加水平重復測定6次，同時計算相對標準偏差來考察精密度，具體結(jié)果見表2。結(jié)果表明，3個添加水平下目標化合物的平均回收率為61.2%～119.5%，相對標準偏差為1.0%～13.7%，符合實際檢測要求。

3 結(jié)論

該試驗建立了蝦肉中大環(huán)內(nèi)酯類、酰胺醇類、硝基咪唑類、磺胺類、四環(huán)素類、喹諾酮類6個大類52種理化性質(zhì)相差較大目標化合物的分析檢測方法。為獲得滿意的分析物回收率，對儀器條件、提取方式、凈化方式進行優(yōu)化，52種獸藥檢出限為0.36～14.00 μg/kg，回收率為61.2%～119.5%。該方法簡單、快速、準確，適用于對大批量蝦類樣品中獸藥殘留的快速篩查，具有較高的實際應用價值。