韓曉磊，梁玨欽，楊慧，王龍泉，熊智，呂慧英

1.湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所（長(zhǎng)沙 410125）；2.湖南省食品測(cè)試分析中心（長(zhǎng)沙 410125）；3.湖南省農(nóng)業(yè)信息與工程研究所（長(zhǎng)沙 410125）；4.西南林業(yè)大學(xué)（昆明 650224）

醬腌菜是腌菜和醬菜等的總稱[1]，蔬菜制品經(jīng)過醬、鹽、糖、醋等腌制加工后的產(chǎn)品稱為醬腌菜[2]。醬腌菜作為居民日常生活飲食的傳統(tǒng)開胃小菜和休閑食品，具有鮮甜脆嫩或咸鮮辛辣等獨(dú)特味道，受到大眾歡迎。采摘后蔬菜瓜果的生長(zhǎng)代謝和腌制中微生物作用是亞硝酸鹽產(chǎn)生的主要來源[3]，在加工腌制中在細(xì)菌還原酶等作用下，大量的硝酸鹽被還原為亞硝酸鹽，易導(dǎo)致過量的亞硝酸鹽累積，從而使食用安全性和產(chǎn)品營養(yǎng)品質(zhì)大幅下降[4]，長(zhǎng)期食用過量的亞硝酸鹽是引發(fā)人體急慢性中毒和癌癥的重要誘因[5]。近年來，醬腌菜亞硝酸鹽超標(biāo)事件時(shí)有發(fā)生，嚴(yán)重威脅大眾身體健康。我國大蒜資源非常豐富，大蒜除含有硫胺素、核黃素、尼克酸、蒜素等化學(xué)物質(zhì)外，還可以通過酶解和化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生多種活性成分，如中二烯丙基三硫化物、二烯丙基二硫化物以及超氧化物歧化酶等，使得大蒜具有廣譜抗菌消炎、抗癌等生理功效[6-10]。超氧化物歧化酶（SOD）是一種廣泛存在天然動(dòng)植物體內(nèi)的酸性蛋白，近年來研究表明大蒜中含有較為豐富的SOD，而且利用效率較高[11]，為大蒜提取物在果蔬抑菌、保鮮和對(duì)亞硝酸鹽降解等方面提供重要的原料基礎(chǔ)，研究其抗菌保鮮具有現(xiàn)實(shí)意義。目前，對(duì)亞硝酸鹽的降解主要集中在人工接種發(fā)酵以及添加抗氧化劑等方面，多數(shù)是利用大蒜提取液中揮發(fā)油、汁及浸出液中所含有大蒜素、大蒜辣素等成分進(jìn)行亞硝酸鹽等有害成分降解[12-16]。有研究表明大蒜SOD還可作為抗氧化劑有效防止罐頭、果汁等食品的變質(zhì)及腐敗現(xiàn)象[17]。而大蒜SOD清除亞硝酸鹽以及對(duì)醬腌菜腌制中積累的亞硝酸鹽進(jìn)行清除和貯藏中營養(yǎng)品質(zhì)影響的研究還未見相關(guān)報(bào)道。

試驗(yàn)以大蒜為基礎(chǔ)原料，利用不同提取方法，采用實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，探究其SOD提取物對(duì)醬腌菜亞硝酸鹽清除效率和營養(yǎng)品質(zhì)影響規(guī)律，以期在醬腌菜生產(chǎn)貯藏中開發(fā)一種來源廣泛且安全無毒的天然抗菌保鮮劑，為保障醬腌菜安全和營養(yǎng)品質(zhì)健康和大蒜綜合利用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料、試劑、設(shè)備

材料：新鮮大蒜（白皮、紫皮）；青菜、白菜等腌制蔬菜原料，精制食鹽及腌制瓷罐等材料均為市售，原料采購后于4 ℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑：木瓜蛋白酶（2000 U/mg），東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；三羥甲基氨甲基烷（99.5%）、焦性沒食子酸（99.0%）、DPPH（Sigma D9132-100 mg 97%）、亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)樣品、鹽酸萘乙二胺、對(duì)氨基苯磺酸、濃硫酸、鹽酸、磷酸、三氯甲烷、乙醇、活性炭、硼砂等，試驗(yàn)中所用試劑均為分析純，用水均為去離子水。

主要儀器與設(shè)備：AL-204型電子天平，美國梅特勒-托利多公司；UV-1700紫外可見光分光光度計(jì)，日本島津；PHB-4型pH計(jì)，雪磁；HR/T16M型高速冷凍離心機(jī)，湖南赫西儀器裝備有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；電子恒溫水浴鍋、超純水系統(tǒng)、臺(tái)式離心機(jī)、酸堿滴定管、榨汁機(jī)、磁力攪拌器等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜SOD活性測(cè)定

采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定。SOD酶活性定義：在1 mL反應(yīng)液中，每分鐘抑制鄰苯三酚自氧化速率50%時(shí)的酶量為一個(gè)活性單位。酶活力值表示：酶活力（U/g）=[（ΔA325-ΔA′325）×100%×4.5×2×D×V1/（ΔA325×V×m1）]。式中：ΔA325為鄰苯三酚自氧化速率；A′325為樣液或SOD酶液抑制鄰苯三酚自氧化速率；V為加入樣液或酶液體積，mL；D為酶液或樣液稀釋倍數(shù)；V1為樣液總體積，mL；m1為樣品的質(zhì)量，g。

1.2.2 大蒜SOD提取物抗氧化能力測(cè)定

采用紫外分光光度法測(cè)定，以提取物對(duì)DPPH自由基清除效率表示抗氧化能力，其清除率計(jì)算公式：清除率=[1-（Ai-Aj）/A0）]×100%。式中：Ai為未加大蒜提取物時(shí)溶液的吸光度；Aj為加入大蒜提取物后溶液的吸光度；A0為大蒜提取液的吸光度[18]。

1.2.3 亞硝酸鹽和營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

亞硝酸鹽采用鹽酸萘乙二胺法測(cè)定，并以清除率為衡量指標(biāo)。清除率計(jì)算公式：清除率=（A1-A2）/A1×100%；式中：A1為未加大蒜提取物時(shí)的吸光度；A2為加入大蒜提取物時(shí)的吸光度。

菌落總數(shù)參照GB 4789—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》方法測(cè)定，可溶性糖采用蒽酮比色法測(cè)定，總酸采用GB/T 123456—2008中酸堿滴定法測(cè)定，氨基酸態(tài)氮測(cè)定采用GB/T 13662—2008中滴定法測(cè)定。

2 提取與測(cè)定

2.1 大蒜SOD提取物的制備與純化

采用磷酸緩沖液法對(duì)白皮大蒜、紫皮大蒜（各2000 g樣品）進(jìn)行提取，首先將蒜瓣去外膜，于攪拌機(jī)攪拌10 min，然后移至研缽中研磨至蒜泥狀，加入2倍樣品體積的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液和5 g木瓜蛋白酶，用榨汁機(jī)使其組織破碎后勻漿。在40 ℃恒溫?cái)嚢杵魃蠑嚢?5 min，調(diào)至pH 6，在4 ℃條件下浸提過夜，用6層紗布抽濾，如此反復(fù)共3次，收集3次抽濾所得初濾液，以6000 r/min離心10 min，得上清液。采用熱變性法、丙酮沉淀法對(duì)提取的粗酶液進(jìn)行純化。將粗酶液分成兩份，一份于60 ℃熱處理10 min，以8500 r/min離心10 min，另一份加入0.6倍體積的丙酮，攪拌15 min。兩份分別于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮并于45 ℃熱風(fēng)干燥至粉末狀，得到純化的大蒜SOD提取物[17]，分別測(cè)定提取物抗氧化能力及酶活力值。

2.2 醬腌菜的制備與提取物的添加

以大白菜、青菜共5 kg為原料，洗凈殺青、瀝干，按照傳統(tǒng)工藝腌制，均勻分成5份，每份添加12%的精制食鹽，混勻，裝入編號(hào)為A1～A5的5個(gè)腌制瓷罐中，分別添加0.0%，0.1%，0.2%，0.3%和0.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的大蒜SOD提取物于瓷罐中，混勻，壓緊蓋上瓷蓋，并以純凈水水封密封，此腌制試驗(yàn)共三平行，保存在恒溫培養(yǎng)箱（25 ℃）中腌制，分別于5，10，15，20和30 d取出適量待測(cè)樣品，測(cè)定亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)及清除效率；將腌制30 d后的A1樣品均勻分成5等份，共2平行，對(duì)應(yīng)添加0.0%，0.1%，0.2%，0.3%和0.5%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的大蒜SOD提取物，混勻，真空包裝后于室內(nèi)常溫貯藏，分別于0，10，20，30，40，60和90 d對(duì)菌落總數(shù)、總酸、可溶性糖、氨基酸態(tài)氮進(jìn)行的測(cè)定，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定結(jié)果以平均值表示，分析其結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 大蒜SOD提取物抗氧化能力測(cè)定

DPPH是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，溶于乙醇時(shí)溶液呈深紫色，該溶液在波長(zhǎng)517 nm處有強(qiáng)的吸收。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，可與其單電子配對(duì)使其溶液褪色吸收降低，其褪色程度與其所接受的電子數(shù)呈線性關(guān)系，因此可以用光度法檢測(cè)自由基的清除情況，從而評(píng)價(jià)自由基清除劑即樣品的抗氧化能力[18]。試驗(yàn)時(shí)，共三平行，準(zhǔn)確吸取5 mL的提取液于10 mL比色管中，然后加入2.0 mL 0.8 mg/mL DPPH溶液，用水定容至刻度，在室溫下反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光度。由圖1可知，兩種提純方法大蒜SOD提取物對(duì)DPPH均具有較強(qiáng)的清除能力，且對(duì)DPPH清除率均隨大蒜提取物用量的增大而增強(qiáng)，具有較明顯的量效關(guān)系，大蒜SOD提取物對(duì)DPPH清除力大排序?yàn)榱姿峋彌_液法+丙酮沉淀法＞磷酸緩沖液法+熱變性法＞磷酸緩沖液法。

3.2 大蒜SOD提取物酶比活力值測(cè)定

由表1可知，兩種不同大蒜樣品經(jīng)過不同提取純化方法得到的大蒜提取物SOD酶比活力均有不同，但品種間SOD活力值差異不顯著（p＞0.05），回收率均較好，經(jīng)過熱變性和丙酮沉淀法，總蛋白濃度下降，總酶活力升高；酶比活力值排序?yàn)闉榱姿峋彌_液法+丙酮沉淀法＞磷酸緩沖液法+熱變性＞磷酸緩沖液法。綜合圖1和表1分析可知，應(yīng)選用白皮大蒜經(jīng)過磷酸緩沖液法+丙酮沉淀法提取物作為此次試驗(yàn)高活性大蒜SOD來源，對(duì)醬腌菜亞硝酸鹽降解及營養(yǎng)品質(zhì)影響進(jìn)行的相關(guān)試驗(yàn)。

圖1 大蒜SOD提取物對(duì)DPPH的清除率

表1 大蒜SOD提取物酶比活力值

3.3 大蒜SOD提取物對(duì)醬腌菜腌制中亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)及清除效率影響

GB 2714—2015《醬腌菜》規(guī)定亞硝酸鹽應(yīng)符合GB 2762—2017中污染物限量值，故亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)（以NaNO2計(jì)）應(yīng)≤20 mg/kg。試驗(yàn)將0～30 d定義為腌制時(shí)間。由圖2可知，空白組亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈先升高后下降的趨勢(shì)，在腌制第10天左右亞硝酸鹽達(dá)到峰值，隨著腌制貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)快速下降，并在腌制期30 d后達(dá)到安全值范圍，處理組亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降程度在腌制期0～30 d呈顯著差異（p＜0.05），其中0.3%和0.5%組在第5天開始就能有效降低亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)，有效抑制亞硝酸鹽峰值質(zhì)量分?jǐn)?shù)，在20 d左右就能使腌制醬腌菜亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到安全值范圍，并在后期持續(xù)抑制亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)。各處理組均對(duì)亞硝酸鹽有一定的清除效率，清除率在15 d內(nèi)隨樣品中添加大蒜SOD提取物濃度的升高而上升，15 d后由于亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)很低以及添加物的消耗，清除效率減弱，0.3%和0.5%添加物與其余組清除率呈顯著差異（p＜0.05）。綜合所述，在醬腌菜腌制過程中，選用0.3%～0.5%的大蒜SOD提取物對(duì)積累的亞硝酸鹽清除較為理想。

圖2 大蒜SOD提取物對(duì)醬腌菜亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)降解及清除效率影響

3.4 大蒜SOD提取在醬腌菜貯藏期間菌落總數(shù)的變化

試驗(yàn)研究的貯藏時(shí)間為腌制完成的樣品經(jīng)包裝未殺菌處理貯藏90 d內(nèi)考察試驗(yàn)結(jié)果。由表2可知，空白組在40 d已變質(zhì)，而添加0.3%和0.5%水平添加物醬腌菜在60 d后才出現(xiàn)變質(zhì)現(xiàn)象，且菌落總數(shù)與CK，0.1%和0.2%呈顯著差異（p＜0.05），醬腌菜制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定菌落總數(shù)小于1～3×104CFU/g，0.3%和0.5%水平在60 d內(nèi)符合安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，可有效抑制微生物的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)包裝后未經(jīng)殺菌的醬腌菜的貯藏時(shí)間至60 d左右。

表2 醬腌菜貯藏期菌落總數(shù)變化 單位：CFU/g

3.5 不同濃度大蒜SOD提取物對(duì)醬腌菜貯藏期間氨基酸態(tài)氮影響

氨基酸態(tài)氮是由醬腌菜中微生物發(fā)酵消耗醬腌菜本身蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的，為微生物的生長(zhǎng)代謝提供能量，微生物過度繁殖會(huì)導(dǎo)致氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，破壞醬腌菜的營養(yǎng)價(jià)值，生成的代謝副產(chǎn)物也會(huì)影響醬腌菜的風(fēng)味[19]，由圖3可知，氨基酸態(tài)氮（以氮計(jì)）隨著醬腌菜貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)總體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，處理組各濃度均能減緩下降趨勢(shì)，但由于0.1%和0.2%濃度較低，減緩趨勢(shì)不明顯，而0.3%和0.5%能夠有效抑制氨基酸態(tài)氮的快速下降，并且在60 d內(nèi)維持在0.5 g/100 g以上水平，兩者差異不明顯（p＞0.05），故綜合成本等因素考慮，選用0.3%～0.5%大蒜SOD提取物較為合適。

圖3 醬腌菜貯藏期氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

3.6 不同濃度大蒜SOD提取物對(duì)醬腌菜貯藏期間總酸影響

醬腌菜中總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加主要是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵產(chǎn)生乳酸，還有一些酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生丁酸等酸性物質(zhì)，使醬腌菜pH降低[19]，由圖4可知，試驗(yàn)各組醬腌菜樣品貯藏期間總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，由于空白樣品無任何添加，總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升最快，0.1%和0.2%提取物雖然能抑制總酸的增加，因其濃度較低，效果不明顯，而0.3%和0.5%可以有效抑制總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，在60 d內(nèi)仍能抑制在1.0 g/100 g以內(nèi)，符合醬腌菜安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

圖4 醬腌菜貯藏期總酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

3.7 不同濃度大蒜SOD提取物對(duì)醬腌菜貯藏期間可溶性糖影響

由圖5可知，醬腌菜在腌制過程中可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)整體呈下降趨勢(shì)，這是因?yàn)獒u腌菜中微生物利用糖類進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸，導(dǎo)致可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)不斷降低。但隨著腌制時(shí)間的延長(zhǎng)，環(huán)境pH降低，乳酸菌的生長(zhǎng)和代謝均受到抑制，其對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力也隨之降低，可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低相對(duì)緩慢下來，最后逐漸趨于穩(wěn)定。0.3%和0.5%處理組在40 d內(nèi)抑制可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)下降與CK，0.1%和0.2%組呈顯著差異（p＜0.05），但兩者差異不明顯，故采用0.3%～0.5%提取物較為合適。

圖5 醬腌菜貯藏期可溶性糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化

4 討論

目前大量研究以及實(shí)踐表明大蒜中天然富含大量超氧化物歧化酶（SOD），從大蒜中提取SOD成本比較低廉，近年來大蒜加工行業(yè)發(fā)展迅猛，加工副產(chǎn)物的利用得到很好的發(fā)展，為大蒜SOD提取提供了豐富的資源基礎(chǔ)。目前大量的研究集中在對(duì)大蒜中大蒜素等物質(zhì)的提取及抗氧化、抗菌等活性的研究，而未涉及對(duì)超氧化物歧化酶的提取，對(duì)提取物應(yīng)用于醬腌菜降亞硝酸鹽和改善營養(yǎng)品質(zhì)方面也缺乏。在消費(fèi)者日趨注重產(chǎn)品的安全和營養(yǎng)品質(zhì)的時(shí)代，醬腌菜在腌制過程中很容易導(dǎo)致亞硝酸鹽的積累，如何控制腌制階段亞硝酸鹽成為關(guān)鍵，此次試驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于在試驗(yàn)范圍內(nèi)，采用常用的實(shí)驗(yàn)室提取手段對(duì)大蒜SOD進(jìn)行提取，并測(cè)定酶活性和對(duì)亞硝酸鹽的清除效率，模擬傳統(tǒng)腌制工藝，在未添加任何防腐劑的情況下，研究其對(duì)醬腌菜營養(yǎng)品質(zhì)變化規(guī)律，找到清除亞硝酸鹽、改善營養(yǎng)品質(zhì)的較好的提取物濃度和貯藏時(shí)間。由于此次試驗(yàn)提取物濃度范圍有限以及對(duì)實(shí)驗(yàn)室模擬醬腌菜腌制貯藏過程與實(shí)際企業(yè)生產(chǎn)存在較大差距，所以下一步研究方向?qū)?duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，還應(yīng)結(jié)合企業(yè)實(shí)踐中對(duì)醬腌菜腌制的工藝類型以及增加提取物濃度范圍進(jìn)行進(jìn)一步探討。

5 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，選用0.3%～0.5%的大蒜SOD提取物對(duì)醬腌菜進(jìn)行處理，能有效降低腌制過程中亞硝酸鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)，降低亞硝酸鹽積累風(fēng)險(xiǎn)，而且能有效減少營養(yǎng)品質(zhì)流失，理論上在常溫條件下延長(zhǎng)未經(jīng)殺菌處理的醬腌菜貯藏期，其貯藏時(shí)間到60 d左右仍能達(dá)到品質(zhì)較好，菌落總數(shù)、總酸以及氨基酸態(tài)氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均呈現(xiàn)較好水平。此次試驗(yàn)為醬腌菜生產(chǎn)企業(yè)開發(fā)天然保鮮劑及提高醬腌菜產(chǎn)品品質(zhì)提供了理論依據(jù)與指導(dǎo)。