趙龍巖，袁孝瑞，劉玉，袁一博，趙圣明

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院（武漢 430070）；2.河南科技學(xué)院食品學(xué)院（新鄉(xiāng) 453003）

山楂葉是薔薇科山楂屬植物的葉子，山楂葉具有強(qiáng)心、清肝消火、降血脂、降血壓、減肥等功效[1]。研究表明山楂葉富含黃酮類、多糖類、微量元素等多種活性成分，有理氣通脈、抗菌消炎等功效[2]。山楂葉多糖作為山楂葉主要的有效活性成分之一，具有降血壓、降血脂和抗氧化等活性功能[3]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)山楂葉多糖的研究主要集中在提取工藝方面的研究。山楂葉多糖作為一種功能保健品原料，將在功能食品的開(kāi)發(fā)領(lǐng)域具有廣闊的市場(chǎng)。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是一種水溶性、由L-谷氨酸和D-谷氨酸聚合形成的陽(yáng)離子聚合物多肽。其無(wú)味，無(wú)毒，具有增稠、凝膠、乳化等活性功能[8]，目前已被廣泛應(yīng)用于食品加工中[4]。γ-聚谷氨酸還具有促進(jìn)礦物質(zhì)元素吸收和掩蓋礦物質(zhì)元素引起的不良風(fēng)味的作用[5]。酸奶由于凝乳不結(jié)實(shí)等因素會(huì)導(dǎo)致酸品質(zhì)下降。通常會(huì)添加一定量的穩(wěn)定劑來(lái)增加其穩(wěn)定性，γ-聚谷氨酸也可提高酸奶穩(wěn)定性且用量少。目前市面上將山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸添加于酸奶制作具有一定保健功能的凝固型酸奶尚未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)測(cè)定添加不同山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸酸奶的乳酸菌活菌數(shù)、持水力、Zeta電位、色澤、粒徑、質(zhì)構(gòu)和抗氧化活性等，研究山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸對(duì)益生菌發(fā)酵酸奶的品質(zhì)影響，為新型功能性酸奶的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山楂葉，采自新鄉(xiāng)南太行山山區(qū)；γ-聚谷氨酸，南京軒凱生物科技有限公司；生牛乳，市售。

1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌），河南科技學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室保藏；DPPH，上海阿拉丁試劑有限公司；其他試劑均為市售分析純。

乳酸菌培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基），北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；CR-400色差計(jì)（日本美能達(dá)公司）；TA-XT.plus質(zhì)構(gòu)儀（英國(guó)Stable Micro Systems公司）；5418高速離心機(jī)（芬蘭Eppendorf公司）；冷凍干燥機(jī)（德國(guó)Christ公司）；Zetasizer Nano-ZS型激光粒度儀（英國(guó) Malvern公司）。

1.4 方法

1.4.1 山楂葉多糖提取

取新鮮的山楂葉烘干后粉碎，過(guò)0.15 mm篩，取篩下物，按照固液比1∶40（g/mL）加入熱水，于90℃水浴提取4 h，按4000 r/min離心20 min，收集上清液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器濃縮至原體積的1/3，離心（5000 r/min，10 min）收集上清液，取上清液加入3倍體積無(wú)水乙醇，于4 ℃醇沉過(guò)夜后離心（按5000 r/min 離心10 min）得沉淀物，經(jīng)冷凍干燥即得山楂葉多糖粗提物[6]。

1.4.2 山楂葉多糖和γ-PGA制備

將生牛乳預(yù)熱至65～68 ℃，加入山楂葉多糖、γ-聚谷氨酸（山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸添加比例；處理組1：0.3 g/L和0.1 g/L；處理組2：0.6 g/L和0.2 g/L；處理組3：0.9 g/L和0.3 g/L；處理組4：0.3 g/L和0.2 g/L；處理組5：0.6 g/L和0.1 g/L；處理組6：0.9 g/L和0.2 g/L）和蔗糖，均質(zhì)；于85 ℃滅菌10 min；冷卻至室溫，分別接種0.1%的發(fā)酵劑，于42 ℃發(fā)酵6 h，于4 ℃后熟24 h，獲得凝固型酸奶[7]。

1.4.3 乳酸菌活菌數(shù)測(cè)定

取25 g酸奶樣品加入225 mL滅菌生理鹽水中，制成10-1的稀釋液，再吸取1 mL加入到9 mL滅菌生理鹽水中，制成10-2的稀釋液，并依次進(jìn)行梯度稀釋。選擇10-5，10-6和10-7三個(gè)梯度，每個(gè)梯度取100 μL稀釋液涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)[8]。

1.4.4 持水力測(cè)定

空離心管質(zhì)量為W0，加入10 mL酸奶，總質(zhì)量為W1。樣品按3000 r/min，4 ℃離心10 min。靜置10 min棄上清液，稱其質(zhì)量W2[9]。持水力按式（1）計(jì)算。

1.4.5 Zeta電位測(cè)定

取1 mL酸奶樣品置于100 mL容量瓶中，定容。將適量樣品置于粒度電位儀凹槽中，運(yùn)行測(cè)定[10]。

1.4.6 色澤測(cè)定

采用CR-400色差計(jì)測(cè)定。采用標(biāo)準(zhǔn)比色板進(jìn)行校正，標(biāo)準(zhǔn)比色板為L(zhǎng)*=97.22，a*=-0.14，b*=1.82。

1.4.7 質(zhì)構(gòu)測(cè)定

參考Bedani等[11]方法，略有改進(jìn)。采用質(zhì)構(gòu)儀選擇質(zhì)地剖面分析測(cè)試模式和P/0.5探頭進(jìn)行測(cè)定。速率：測(cè)前2.0 mm/s、測(cè)中1.0 mm/s和測(cè)后2.0 mm/s，下壓間隔1 s，最小觸發(fā)力0.3 N。

1.4.8 DPPH自由基清除能力的測(cè)定

將1 g酸奶樣品溶解到9 mL 95%的無(wú)水乙醇中，向2 mL樣品溶液中加入2 mL 0.16 mmol/L DPPH乙醇溶液，于25 ℃水浴30 min，在517 nm處測(cè)試樣吸光度（Ai）。以2 mL蒸餾水代替樣品測(cè)得空白吸光度（A0）。以2 mL 95%乙醇代替2 mL DPPH乙醇溶液。測(cè)得樣品本底吸光度（Aj）[12]。按式（2）計(jì)算清除率。

1.4.9 粒徑測(cè)定

樣品經(jīng)稀釋至澄清透明后靜置30 min，倒入比色皿中采用粒度分析儀進(jìn)行測(cè)定。

1.4.10 酸奶感官評(píng)定

根據(jù)表1所示的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，選取10位有酸奶感官評(píng)定經(jīng)驗(yàn)的老師，根據(jù)酸奶的色澤、組織狀態(tài)、口感和風(fēng)味四個(gè)方面對(duì)酸奶進(jìn)行感官評(píng)定。滿分100分。

表1 酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.4.11 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用Excel 2010軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)乳酸菌活菌數(shù)的影響

乳酸菌活菌數(shù)是評(píng)價(jià)酸乳品質(zhì)的重要指標(biāo)，添加不同濃度山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸對(duì)酸奶乳酸菌活菌數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出：處理組乳酸菌活菌數(shù)均高于空白對(duì)照組，且處理組3和處理組6活菌數(shù)最高，達(dá)到了109以上。主要因?yàn)樯介~多糖和γ-聚谷氨酸可作為益生元，促進(jìn)乳酸菌的生長(zhǎng)繁殖，使發(fā)酵乳中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)得到充分的利用，發(fā)酵產(chǎn)生更多的活性物質(zhì)，對(duì)人體產(chǎn)生更好的益生效果[13]。

表2 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)乳酸菌活菌數(shù)的影響

2.2 山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸對(duì)酸奶持水力的影響

持水力是影響發(fā)酵乳質(zhì)量的重要因素。添加不同濃度的山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸對(duì)酸奶持水力的影響見(jiàn)圖1。從圖1可以看出：所有處理組酸奶的持水力均高于空白對(duì)照組，其中處理組2的持水力最高，達(dá)到80.6%。有研究表明添加適量的山楂葉多糖能夠促進(jìn)酪蛋白相互作用，且γ-聚谷氨酸的添加提高了乳中蛋白質(zhì)和總固形物的含量，減少乳清析出，從而使持水力升高[14]。山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸可以協(xié)同提高酸奶的持水力，改善發(fā)酵乳的品質(zhì)。

圖1 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶持水力的影響

2.3 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶Zeta電位的影響

Zeta電位絕對(duì)值反映的是整個(gè)酸奶體系的穩(wěn)定性。添加不同濃度山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸對(duì)酸奶Zeta電位見(jiàn)圖2。從圖2可以看出：所有處理組酸奶的Zeta電位均高于空白對(duì)照組，其中處理組2的Zeta電位的絕對(duì)值最高，達(dá)到12.58。Zeta電位絕對(duì)值越大，酸奶的穩(wěn)定性越好。γ-聚谷氨酸吸附于酪蛋白的表面，形成雙電子層，從而酪蛋白與γ-聚谷氨酸形成復(fù)合物。而復(fù)合物之間可能同時(shí)存在著靜電引力和靜電斥力以及范德華力，這幾種力的相互作用，使酸奶保持較為穩(wěn)定的平衡狀態(tài)[15]。

圖2 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶Zeta電位的影響

2.4 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶色澤的影響

L*、a*和b*值分別表示樣品從亮到暗、從綠變紅以及從藍(lán)變黃的過(guò)程[16]。添加不同濃度山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸酸奶色澤結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出：所有處理組酸奶的L*值均低于空白對(duì)照組，而a*值和b*值均高于空白對(duì)照組。且添加不同濃度山楂葉多糖酸奶的L*、a*和b*值與對(duì)照組之間具有顯著性差異（p＜0.05）。這主要因?yàn)樯介~多糖本身呈褐色，隨著添加量的增加，酸奶的顏色逐漸變暗，賦予酸奶褐色的色澤。

表3 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶色澤的影響

2.5 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶質(zhì)構(gòu)的影響

添加不同濃度山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸的酸奶質(zhì)構(gòu)參數(shù)見(jiàn)表4。從表4可以看出：所有處理組酸奶的硬度、咀嚼性和黏性均高于空白對(duì)照組。其中處理組2，酸奶的硬度、咀嚼性和黏性最高，分別達(dá)到17.12，6.24和57.23。硬度、咀嚼性和黏性越大，說(shuō)明酸奶的凝固狀態(tài)越好。山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸對(duì)酸奶質(zhì)構(gòu)的改善主要可能是因?yàn)檫m量的山楂葉多糖和酸奶中的酪蛋白發(fā)生相互作用，促進(jìn)了酸奶發(fā)酵過(guò)程中酪蛋白分子作用力，形成更加穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[17]。

表4 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶質(zhì)構(gòu)特性的影響

2.6 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶DPPH自由基清除能力的影響

DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，抗氧化劑可與DPPH上的孤對(duì)電子配對(duì)，導(dǎo)致其在517 nm附近的光吸收減弱或消失，因此可以利用光吸收減弱程度來(lái)判斷抗氧化劑的抗氧化能力[18]。添加不同濃度山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸對(duì)酸奶DPPH自由基清除能力結(jié)果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出：所有處理組酸奶的DPPH自由基清除能力均高于空白對(duì)照組。主要是因?yàn)樯介~多糖和γ-聚谷氨酸中含有供氫物質(zhì)，因此能提高酸奶對(duì)DPPH自由基清除能力。

圖3 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶DPPH自由基清除能力的影響

2.7 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶粒徑的影響

添加不同濃度山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸酸奶粒徑結(jié)果見(jiàn)圖4。從圖4可以看出：處理組酸奶的粒徑均小于空白對(duì)照組。處理組2酸奶的粒徑最小。粒徑越小，酸奶的體系穩(wěn)定性越好?？赡苁且?yàn)樯介~多糖和γ-聚谷氨酸帶負(fù)電，可以通過(guò)靜電引力吸附在帶正電的酪蛋白表面形成雙電子層。由于三種粒子之間強(qiáng)烈的靜電引力，導(dǎo)致間距變短，粒徑減小。

圖4 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶粒徑的影響

2.8 山楂葉多糖和γ-PGA對(duì)酸奶感官品質(zhì)的影響

添加不同濃度山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸對(duì)酸奶感官品質(zhì)的影響見(jiàn)圖5。從圖5可以看出：所有處理組酸奶的評(píng)分均高于空白對(duì)照組。說(shuō)明添加一定量的山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸可以增加發(fā)酵乳的風(fēng)味，改善發(fā)酵乳的組織狀態(tài)，提高發(fā)酵乳的口感。

圖5 酸奶的感官評(píng)價(jià)

3 結(jié)論

添加山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸可以提高酸奶中益生乳酸菌的活菌數(shù)、持水力、Zeta電位和抗氧化活性以及改善發(fā)酵乳色澤、粒徑和質(zhì)構(gòu)特性等；還可以有效改善酸奶的組織狀態(tài)，增強(qiáng)發(fā)酵乳的風(fēng)味，提高發(fā)酵乳的品質(zhì)。當(dāng)山楂葉多糖和γ-聚谷氨酸添加量分別為0.6 g/L和0.2 g/L時(shí)，酸乳的持水力、Zeta電位、粒徑、質(zhì)構(gòu)特性和感官評(píng)價(jià)最佳。