時(shí)寧寧，阮長(zhǎng)青，李志江，張東杰

1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院（大慶 163319）；2.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（大慶 163319）；3.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心（大慶 163319）；4.黑龍江省雜糧加工及質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心（大慶 163319）

黑豆為雙子葉植物綱豆科大豆屬植物的黑色種子，此類植物耐干旱、耐貧瘠，而且營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，主要產(chǎn)地分布于我國(guó)東北、山西、河北等地[1-2]。黑豆素稱“植物蛋白之王”，蛋白質(zhì)含量普遍高于其他豆類，并且其血糖生成指數(shù)較低，除此之外植物黑豆皮色素的主要成分是花色苷，其總酚含量及其抗氧化活性均顯著高于黃豆[3-4]。黑豆高蛋白、低熱量的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，及其特殊的生理功能活性和藥用價(jià)值，使得以黑豆為基礎(chǔ)物質(zhì)開發(fā)的一系列功能產(chǎn)品具有廣闊的市場(chǎng)空間和前景[5-6]。但是豆類及谷物中普遍存在抗?fàn)I養(yǎng)因子，會(huì)降低食物中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物利用率，在一定程度上還可能會(huì)引起機(jī)體的不適。

植酸，又叫肌醇六磷酸酯，由環(huán)己六醇與六個(gè)磷酸基團(tuán)結(jié)合而成，其水溶性較好，可溶于乙醇（含水）和丙酮，微溶于甲醇和無水乙醇，在植物種子中以其鹽類的形式存在，植物里60%～80%的磷存在于植酸中，是磷的主要儲(chǔ)存化合物，其中豆類、玉米、小麥和大米等植物籽粒的大部分植酸分別存在于種子、子葉、麩皮和胚芽中，較寬的pH范圍內(nèi)植酸仍具有很強(qiáng)的螯合金屬離子的作用[7-10]。相關(guān)研究表明，通過植酸對(duì)金屬離子的捕捉作用，在一定程度上可以起到保護(hù)牙齒、預(yù)防腎結(jié)石以及防治糖尿病的效果，并且植酸攝入量相對(duì)較高的人群其患癌率較低[11-12]。但是，由于人體和單胃動(dòng)物體內(nèi)缺少植酸酶，植酸進(jìn)入胃腸道后會(huì)與礦物質(zhì)以及蛋白質(zhì)形成復(fù)合物改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并會(huì)影響相關(guān)酶的活性，從而降低了食物中的金屬離子、蛋白質(zhì)、淀粉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度[13-15]。此外，植酸的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，一般的加工方式難以去除，只有在植酸酶的作用下，植酸被水解成低級(jí)肌醇磷酸酯，才能有效消除植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用[16-17]。

目前，植酸的相關(guān)研究多數(shù)集中在動(dòng)物飼料上，如麩皮、豆粕、菜籽粕等，并且均是通過監(jiān)測(cè)動(dòng)物體重變化、磷利用率等手段來研究植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用，對(duì)于植酸與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的生物有效性關(guān)系的研究相對(duì)較少。黑豆作為一種深色粗糧，更符合當(dāng)前的營(yíng)養(yǎng)理念，但是尚未見到黑豆中植酸的相關(guān)研究報(bào)道。試驗(yàn)以黑豆為試材，根據(jù)植酸鹽在較低pH下會(huì)發(fā)生水解的性質(zhì)來提取植酸，以鹽酸作為浸提液，對(duì)提取過程的影響因素進(jìn)行條件優(yōu)化，從而得到黑豆中植酸提取的最佳條件，并且能夠明確黑豆中植酸的具體含量，可為黑豆中植酸的分布、結(jié)構(gòu)特性、生物活性以及抗?fàn)I養(yǎng)作用等相關(guān)特性研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆，龍黑1號(hào)，黑龍江大慶市林甸縣。

植酸，純度99%，上海麥克林生化科技有限公司；甘氨酸，德國(guó)Biofroxx公司；濃鹽酸，天津富宇精細(xì)化工有限公司；三氯化鐵，天津市永晟精細(xì)化工有限公司；磺基水楊酸，遼寧泉瑞試劑有限公司；無水硫酸鈉，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2204B電子天平，上海天美天平儀器有限公司；HZQ-c氣浴恒溫振蕩器，常州金壇良友儀器有限公司；DZG-6020真空干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TG16-WS高速離心機(jī)，長(zhǎng)沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司；723N可見分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司制造；PHS-3C pH計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植酸的提取方法

根據(jù)文獻(xiàn)[18-19]進(jìn)行適當(dāng)修改。黑豆洗凈烘干后，粉碎過0.425 mm篩，稱取2.0000 g黑豆粉于錐形瓶中，并加入一定pH的10%硫酸鈉-鹽酸溶液，在一定條件下振蕩，結(jié)束后于10000 r/min離心10 min，將上清液移至50 mL容量瓶，定容備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)文獻(xiàn)[20-21]進(jìn)行適當(dāng)修改。分別取40，80，120，160和200 μL 1 mg/mL植酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，使用甘氨酸-鹽酸緩沖溶液（pH 2.4）定容，得到質(zhì)量濃度為20，40，60，80和100 μg/mL的植酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別移取5 mL于離心管中，分別添加3 mL顯色劑（0.03%三氯化鐵-0.3%磺基水楊酸），搖勻靜置15 min，按10000 r/min離心10 min，于498 nm測(cè)上清液吸光度，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 植酸得率的測(cè)定

取0.2 mL提取液于15 mL離心管中，補(bǔ)加pH 2.4的甘氨酸-鹽酸緩沖溶液至5 mL，再加入3 mL顯色劑（0.03%三氯化鐵-0.3%磺基水楊酸），之后步驟同1.3.2小節(jié)，并通過植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出0.2 mL提取液中植酸得率。

式中：R為植酸得率，mg/g；m為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的0.2 mL提取液中植酸的質(zhì)量，mg；M為原料質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.4.1 提取pH對(duì)植酸得率的影響

稱取2.0000 g黑豆粉，按料液比1∶14（g/mL）加入pH分別為1，2，3，4和5的提取劑，于30 ℃振蕩2 h，離心后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶。

1.3.4.2 提取料液比對(duì)植酸得率的影響

稱取2.0000 g黑豆粉，分別按料液比1∶8，1∶10，1∶12，1∶14和1∶16（g/mL）加入pH 2的10%硫酸鈉-鹽酸溶液，于30 ℃振蕩2 h，離心得上清液，定容至50 mL容量瓶。

1.3.4.3 提取時(shí)間對(duì)植酸得率的影響

稱取2.0000 g黑豆粉，按料液比1∶14（g/mL），加入pH 2的提取劑，于30 ℃振蕩提取，提取時(shí)間分別為0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h，離心后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶。

1.3.4.4 提取溫度對(duì)植酸得率的影響

稱取2.0000 g黑豆粉，按料液比1∶14（g/mL），加入pH 2的提取劑，分別在30，40，50，60和70 ℃下振蕩2.0 h，離心后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶。

1.3.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇料液比、提取pH、溫度、時(shí)間為試驗(yàn)因素，每個(gè)因素取3個(gè)水平，以植酸得率為指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1）。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)結(jié)果均是3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

植酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=-2.678x+0.527，R2=0.999，其中y為測(cè)定的吸光度，x為溶液中的植酸含量，線性范圍在0～0.1 mg之間。

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 溶液pH對(duì)植酸得率的影響

由圖1可知，浸提液的pH對(duì)植酸得率的影響較大，隨著pH的增加，植酸得率呈現(xiàn)一個(gè)先上升后下降的趨勢(shì)，在pH 2時(shí)植酸得率達(dá)到最大。游離植酸與植酸鹽在一定的pH范圍內(nèi)可以相互轉(zhuǎn)換，pH降低時(shí)，植酸與金屬陽離子之間的絡(luò)合作用會(huì)逐漸減弱，植酸被釋放出來，但是在較低pH下，由于一些酸性多糖和蛋白的溶出又會(huì)使游離植酸含量降低[22-23]。因此選擇pH 2為最佳提取pH。

圖1 pH對(duì)植酸得率的影響

2.2.2 料液比對(duì)植酸得率的影響

由圖2可知，在1∶8～1∶16（g/mL）料液比的范圍內(nèi)，植酸得率隨著料液比的變化先迅速增加，之后在1∶14（g/mL）時(shí)趨于平緩。在液體質(zhì)量濃度比較低時(shí)，由于溶劑較少，黑豆粉不能夠被充分浸泡，使得植酸不能很好地溶出，隨著液體質(zhì)量濃度的增大，黑豆粉在溶劑中可以處于一種分散狀態(tài)，更有利于植酸的溶出，并且植酸的擴(kuò)散速率也會(huì)隨之增大，使植酸能夠充分進(jìn)入到溶劑中[24]。因此選擇1∶14（g/mL）作為提取的最佳料液比。

圖2 料液比對(duì)植酸得率的影響

2.2.3 浸提時(shí)間對(duì)植酸得率的影響

由圖3可知，在0.5～1.5 h范圍內(nèi)，植酸得率逐漸增大，在1.5 h時(shí)植酸得率達(dá)到最大值，此時(shí)繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，植酸得率則出現(xiàn)小幅度的下降趨勢(shì)。植酸的溶出是一個(gè)動(dòng)態(tài)的過程，并且需要一定的時(shí)間植酸才能夠充分地游離出來，當(dāng)植酸的溶出達(dá)到平衡后，此時(shí)如果繼續(xù)延長(zhǎng)浸提時(shí)間，游離出的部分植酸會(huì)與環(huán)境中的其他物質(zhì)形成復(fù)合物，從而使植酸得率呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)[25]。因此選擇1.5 h為最佳提取時(shí)間。

圖3 時(shí)間對(duì)植酸得率的影響

2.2.4 浸提溫度對(duì)植酸得率的影響

由圖4可知，在30～60 ℃范圍內(nèi)，隨著浸提溫度的升高，植酸得率也在不斷增大，在60 ℃時(shí)達(dá)到最大值，若繼續(xù)增加溫度，植酸得率出現(xiàn)下降趨勢(shì)?？紤]到植酸的熱穩(wěn)定較強(qiáng)，以及黑豆的內(nèi)源植酸酶在低pH和高溫下已經(jīng)失活，因此植酸因高溫和酶作用而發(fā)生分解從而導(dǎo)致得率降低的可能性較低。黑豆蛋白含量較高，而蛋白質(zhì)在較高溫度下長(zhǎng)時(shí)間水浴會(huì)發(fā)生變性，從而聚集沉淀，由此推斷較高溫度下蛋白聚集沉淀導(dǎo)致植酸與蛋白復(fù)合物存在于殘?jiān)校瑥亩固崛∫褐兄菜岬牡寐蕼p少[26]。因此選擇60 ℃為最佳提取溫度。

圖4 溫度對(duì)植酸得率的影響

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2和表3可知，4個(gè)因素對(duì)植酸得率的影響主次順序?yàn)閜H＞料液比＞時(shí)間＞溫度，料液比、pH、時(shí)間對(duì)植酸得率的影響為極顯著，提取溫度影響顯著，確定植酸提取的最佳工藝條件A3B2C2D2，即料液比1∶16（g/mL）、pH 2、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間1.5 h，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，植酸得率平均值為10.71 mg/g。

表2 正交試驗(yàn)直觀分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

3 結(jié)論

以黑豆為原料，選擇10%硫酸鈉-鹽酸作為浸提液，考察了料液比、pH、時(shí)間、溫度對(duì)黑豆中植酸提取的影響，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，獲得最佳提取工藝：料液比1∶16（g/mL）、pH 2、溫度60 ℃、時(shí)間1.5 h，在此條件下植酸得率為10.71 mg/g。研究建立了黑豆中植酸的提取方法，并且明確了黑豆中植酸的具體得率，可為黑豆中植酸的分離純化提供技術(shù)支持，并對(duì)后續(xù)黑豆中植酸的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及抗?fàn)I養(yǎng)作用等相關(guān)研究提供一定的研究基礎(chǔ)。酸浸法是提取植酸的普遍方法，依據(jù)的是植酸與植酸鹽在一定的pH范圍內(nèi)能夠相互轉(zhuǎn)換，但該方法存在的問題是提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率相對(duì)偏低，因此可考慮結(jié)合超聲、微波等輔助手段進(jìn)行提取，以提升植酸得率以及縮短提取時(shí)間[27]。