王帥勇，汪 琪，朱世強(qiáng)，姚 云，虞凌雪，劉曉敏，單同領(lǐng)，鄭 浩，周艷君，童 武，李國(guó)新，高 飛，童光志，于 海

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是一種單股環(huán)狀DNA病毒。之前的研究發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒分為PCV1和PCV2兩個(gè)基因型，PCV1是由Tischer等[1]在1974年發(fā)現(xiàn)并被認(rèn)為是一種細(xì)胞污染物，對(duì)豬群沒(méi)有致病性；PCV2最早是由Clark等[2]在1991年于加拿大被發(fā)現(xiàn)的，對(duì)豬群有較強(qiáng)的致病性。很多研究表明PCV2是豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾?。╬orcine circovirus associated diseases，PCVAD）的主要病原，能夠引起豬的多種疾病，主要包括：斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisytemic wasting syndrome，PMWS）、豬皮炎與腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）以及仔豬震顫（congenital tremors，CT），給養(yǎng)豬業(yè)造成了非常嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。

2016年，Palinski等[5]首次在美國(guó)發(fā)現(xiàn)新的PCV基因型并命名為豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3），該病毒能夠引起多種豬病，與PCVAD非常相似。PCV3的基因組全長(zhǎng)為2000 bp，主要包括3個(gè)開(kāi)放性閱讀框（opening reading frame，ORF），其中ORF1主要編碼Rep蛋白，與病毒的復(fù)制相關(guān)，ORF2主要編碼Cap蛋白，該蛋白是病毒的唯一結(jié)構(gòu)蛋白，與病毒的感染和免疫有較強(qiáng)的相關(guān)性。

目前為止，已經(jīng)有多個(gè)國(guó)家都有關(guān)于PCV3的報(bào)道，包括中國(guó)、巴西、德國(guó)、意大利和俄羅斯等[6-10]。通過(guò)PCV3在中國(guó)不同地區(qū)流行情況的報(bào)道可以看出，PCV3已經(jīng)廣泛存在于中國(guó)的豬群當(dāng)中，本實(shí)驗(yàn)室在之前的流行病學(xué)調(diào)查過(guò)程當(dāng)中檢測(cè)到了PCV3的陽(yáng)性病料，通過(guò)測(cè)序獲得了7株P(guān)CV3全長(zhǎng)基因序列，本研究選取其中1株作為代表株，設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)去核定位信號(hào)的ORF2特異性引物，成功擴(kuò)增PCV3全長(zhǎng)基因序列并將其連接到pCold TF載體上，構(gòu)建了重組的原核表達(dá)質(zhì)粒并對(duì)其進(jìn)行了原核表達(dá)，獲得了可溶性的重組蛋白并且對(duì)蛋白的抗原性進(jìn)行了鑒定和分析，為進(jìn)一步研究PCV3 Cap 蛋白的功能及建立間接ELISA檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)，并為防控PCV3提供了特異、高效的檢測(cè)工具。

1 材料與方法

1.1 載體、菌株 載體pCold TF由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌E.coliDH5α、表達(dá)宿主菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技有限公司；IPTG購(gòu)自Sigma公司；限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和SaIⅠ、病毒DNA提取試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；pfu高保真DNA聚合酶購(gòu)自Agilent Technologies公司；引物由金唯智生物公司合成；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自CST公司；DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 應(yīng)用Primer premier5.0軟件，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前在檢測(cè)病料過(guò)程中通過(guò)測(cè)序獲得的1株P(guān)CV3全基因組序列設(shè)計(jì)1對(duì)去掉Cap蛋白N端核定位信號(hào)（34個(gè)氨基酸）的特異性引物，分析pCold TF載體質(zhì)粒圖譜，分別在引物的上、下游加入XhoⅠ和SaIⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基（劃線的堿基）。上游引物：5'-CCGCTCGAGATGAGACACA GAGCTATATA-3'；下游引物：5'-ACGCGTCGAC TTAGAGAACGGACTTGTAA-3'。

1.3 病毒DNA的提取及目的基因的PCR擴(kuò)增 取實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)為陽(yáng)性的病料進(jìn)行研磨，將研磨液10 000 ×g離心10 min，將離心后的上清液按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取病毒DNA全基因組，并以此為模板，通過(guò)PCR進(jìn)行Cap目的基因片段的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：ddH2O 37 μL，10×pfu Ultra ⅡRxn Buffer 5 μL，上、下游引物各2 μL，dNTP 1 μL，DNA 2 μL，pfu Ultra Ⅱ Fusion Hs DNA 1 μL，總體積為50 μL。將上述PCR反應(yīng)體系進(jìn)行震蕩混勻后離心，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性1 min；95℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。擴(kuò)增后的核酸產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠進(jìn)行膠回收。

1.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將膠回收產(chǎn)物同pCold TF空載體經(jīng)限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和SaIⅠ雙酶切5 h，膠回收Cap和載體的目的片段，用T4 DNA連接酶16℃過(guò)夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單個(gè)菌落在水平搖床上培養(yǎng)16 h，菌液PCR鑒定后，將陽(yáng)性菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的陽(yáng)性菌液擴(kuò)增，提取質(zhì)粒，獲得的陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pCold TF-dPCV3Cap。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 將重組表達(dá)質(zhì)粒pCold TF-PCV3-dCap轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，挑取單菌落在水平搖床上進(jìn)行增菌培養(yǎng)；當(dāng)菌液濃度活化至OD600值達(dá)0.7左右，按照1∶1000比例加入終濃度為1 mol/mL的IPTG；將菌液轉(zhuǎn)入水平搖床上分別誘導(dǎo)12、16、20和24 h后收集菌液，10 000 ×g離心10 min取上清液，用適量PBS重懸沉淀并取出適量重懸液與SDSPAGE緩沖上樣液充分混勻，沸水浴10 min。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳分析，確定IPTG的最佳誘導(dǎo)時(shí)間。

1.6 重組蛋白的可溶性分析 收集誘導(dǎo)后的菌液，10 000 ×g離心10 min，用適量PBS重懸后在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎，每次超聲5 s，間隔5 s，破碎至菌液澄清。將破碎后的菌液10 000 ×g離心10 min后，分別收集上清液和沉淀。在沉淀中加入與上清液等體積的PBS重懸，然后取出適量重懸液與SDSPAGE緩沖上樣液充分混勻，沸水浴10 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。

1.7 重組蛋白的純化 大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，收集菌液，10 000 ×g離心10 min，用適量PBS重懸后在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎并收集上清液，按照磁珠蛋白純化說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化，用SDS-PAGE來(lái)檢測(cè)蛋白純度。

1.8 重組蛋白的Western blot鑒定 將純化后的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳，轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素（NC）膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，用小鼠陽(yáng)性血清作為一抗（1∶5000稀釋），在4℃搖床上孵育過(guò)夜，用TBST漂洗3次，每次10 min；以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠lgG為二抗（1∶5000稀釋），常溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次10 min，最后應(yīng)用DAB顯色液進(jìn)行顯色反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的擴(kuò)增 用設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增Cap蛋白的基因片段，命名為PCV3-dCap，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后獲得與預(yù)期大小相符的目的條帶（圖1）。

圖1 PCV3-dCap基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The PCR products of PCV3-dCap gene

2.2 重組質(zhì)粒pCold TF-PCV3-dCap的構(gòu)建及鑒定 將擴(kuò)增的目的片段與pCold TF載體連接后，通過(guò)PCR方法進(jìn)行菌液鑒定及陽(yáng)性重組質(zhì)粒的序列測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示，PCV3-dCap片段成功連接到pCold TF載體上，并且沒(méi)有出現(xiàn)堿基突變和缺失，將獲得的重組質(zhì)粒命名為pCold TF-PCV3-dCap。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE分析 通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后收集到大量菌液，取超聲破碎和離心后的上清液及沉淀進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。結(jié)果顯示，重組蛋白能夠在上清液中大量表達(dá)，大小為75 kDa，與預(yù)期一致（圖2）。同時(shí)將通過(guò)不同誘導(dǎo)時(shí)間的上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)時(shí)間為20 h時(shí)，重組蛋白的表達(dá)量最大。

圖2 重組蛋白表達(dá)可溶 性分析Fig.2 Soluble analysis of recombinant pCold TF-PCV3-dCap protein by SDS-PAGE

2.4 重組蛋白的純化 在最佳誘導(dǎo)條件下，大量誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，收集菌液后進(jìn)行超聲破碎和離心，將上清液按照磁珠蛋白純化盒的說(shuō)明進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，目的蛋白純度較高且單一（圖3）。

圖3 重組蛋白的純化Fig.3 The purification of recombinant protein

2.5 重組蛋白的Western blot鑒定 以陰性小鼠血清作為一抗來(lái)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，重組蛋白和誘導(dǎo)空載體表達(dá)的蛋白在目的條帶位置均沒(méi)有出現(xiàn)任何條帶（圖4A）。同時(shí)，以陽(yáng)性小鼠血清作為一抗來(lái)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示重組蛋白在目標(biāo)條帶位置有明顯的條帶，而誘導(dǎo)空載體所表達(dá)的蛋白在目標(biāo)條帶處沒(méi)有條帶（圖4B），表明pCold TF-dPCV3-Cap重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性和特異性。

圖4 重組蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of the recombinant protein

3 討論

自2016年首次發(fā)現(xiàn)PCV3以來(lái)，世界各地均有發(fā)現(xiàn)PCV3的相關(guān)報(bào)道，由于PCV容易與多種豬源性病原體發(fā)生混合感染[4]，導(dǎo)致豬的多種疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。PCV感染細(xì)胞后不發(fā)生細(xì)胞病變，截止目前，世界范圍內(nèi)還沒(méi)有成功分離到PCV3野毒株。目前已有多篇報(bào)道表明存在PCV2和PCV3共感染的情況[11]，因此建立針對(duì)PCV3的特異性檢測(cè)方法非常重要。當(dāng)前針對(duì)于PCV的主要防控方式是疫苗接種，因此反應(yīng)原性和特異性較好的原核表達(dá)蛋白對(duì)于亞單位疫苗的研發(fā)也具有重要的意義[12]。Cap蛋白是PCV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，主要與病毒的感染復(fù)制有關(guān)，同時(shí)也是檢測(cè)PCV的主要指標(biāo)，目前已經(jīng)有研究表明，PCV2和PCV3的Cap基因同源性很低，兩者之間無(wú)法提供交叉保護(hù)[13-14]。因此對(duì)于PCV3的Cap蛋白的研究具有重要的意義[15]。

本研究通過(guò)原核表達(dá)方式所獲得的PCV3-dCap蛋白主要在上清液中表達(dá)，在表達(dá)過(guò)程中無(wú)需處理包涵體，這為大量表達(dá)該蛋白帶來(lái)了很大的便利，同時(shí)本研究所采用的磁珠純化蛋白的方式較為簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，在大量純化蛋白時(shí)能夠極大的提高純化效率。使用純化后的重組蛋白免疫小鼠，得到的陽(yáng)性小鼠血清能夠與重組蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，證明了該蛋白具有良好的免疫原性。本研究原核表達(dá)的重組蛋白為建立PCV3抗體特異性檢測(cè)方法和亞單位疫苗的研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。