曹敬政 ，安 靜 ，蔣 蔚 ，辛思培 ，宋 斌 ，李 思 ，王 權(quán) ，孫衛(wèi)東

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.新疆農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，烏魯木齊 830000；3.南京農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，南京 210095）

氟喹諾酮類藥物（FQs）屬于第三類喹諾酮類藥物，是一類人工合成的含有4-喹諾酮母核結(jié)構(gòu)[1]，C-6位上連接氟原子，C-7位有哌嗪環(huán)的一類廣譜抗菌藥物[2]。該類抗生素相比于其他喹諾酮類藥物抗菌譜更廣，對革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌均有明顯的抑制作用[3-4]，已被廣泛應用于畜禽和水產(chǎn)動物疾病，其殺菌作用主要是通過靶向抑制細菌促旋酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ的合成來抑制細菌DNA的復制[5-6]。該類藥物大劑量攝入可導致動物急性中毒，長期低劑量攝入可導致動物機體對該藥產(chǎn)生耐藥性；其不合理使用或濫用會引發(fā)藥物殘留，進而通過食物鏈危害人類的健康，所以國家對于動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留的檢測與控制非常重視。

我國規(guī)定對不同氟喹諾酮類藥物的最高殘留限量（MRLs）為10 μg/kg～1000 μg/kg，在2292號公告中已經(jīng)規(guī)定自2016年12月31日開始停止諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星和氧氟沙星4種氟喹諾酮類藥物在食品動物中的使用和經(jīng)營[7]。目前對于氟喹諾酮類藥物殘留檢測方法主要有微生物法[8]、高效液相色譜法[9]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10-12]、高效毛細管電泳法[13]、免疫分析法[14-15]。其中微生物法檢測限過低，靈敏度不高；色譜-質(zhì)譜法的檢測靈敏度及精確度比較高，但是用于檢測的儀器設備價格比較昂貴，而且樣品的前處理費時費力，不適用于對樣品的大量、快速的篩選。免疫分析法以其靈敏度高，特異性強，檢測快速簡單而廣泛的應用于藥物殘留的檢測中，主要有酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[16]、免疫層析試紙法（immuno-chromatographicassay，ICA）[17-19]、放射免疫法（radio immunoassay，RIA）[20]、化學發(fā)光酶免疫法（chemiluminescent enzyme immunoassay，CLEIA）[14]。其中CLEIA是一種與ELISA較為相似的酶免疫分析方法[21]。由于其具有靈敏度高、檢測時間短、檢測數(shù)值范圍寬、光信號持續(xù)時間長等優(yōu)點[22-23]，并且克服了儀器檢測法所用儀器昂貴和對操作人員的專業(yè)性要求較高的缺點，逐漸成為免疫學檢測的重要發(fā)展方向之一。

由于同一類抗生素開發(fā)的品種越來越多，同類抗生素需進行殘留監(jiān)測品種也越多。單一抗生素殘留的快速檢測技術(shù)通常難以滿足實際檢測的需要。因此，發(fā)展同一類抗生素藥物總或多殘留快速檢測技術(shù)是當前國內(nèi)外動物源性產(chǎn)品質(zhì)量安全研究領域的前沿和發(fā)展趨勢之一。

廣泛應用的氟喹諾酮類藥物（FQs）藥物達十幾種之多，如果針對每一種FQs藥物都建立一種檢測方法，費時費力。本文通過制備針對FQs母環(huán)結(jié)構(gòu)相似結(jié)構(gòu)藥物諾氟沙星的寬譜特異性的單克隆抗體，將抗體識別藥物的廣譜性與CLEIA的高靈敏性結(jié)合起來，建立了一種能夠檢測多種氟喹諾酮類藥物（FQs）的CLEIA法。

1 材料與方法

1.1 材料 諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、洛美沙星、那氟沙星、恩諾沙星、依諾沙星、氧氟沙星、麻保沙星、達氟沙星、沙拉沙星、二氟沙星等氟喹諾酮類藥物購自阿拉丁試劑有限公司；牛血清白蛋白、N-羥基琥珀酸亞胺購自Sigma公司；辣根過氧化物酶購自中國科學院上海生物化學研究所；1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺、二甲基甲酰胺購自國藥集團化學試劑有限公司；胎牛血清購自GIBCO公司；DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；HiTrapTMPro-tein G純化柱購自美國GE Healthcare公司；化學發(fā)光底物購自湖州英創(chuàng)生物技術(shù)有限公司；超高性能化學發(fā)光檢測儀購自Bio-Tek公司。

1.2 完全抗原的制備與鑒定

1.2.1 半抗原的改造 參考Li等[24]的方法，選擇半抗原藥物NOR（諾氟沙星）進行改造，將三頸燒瓶中的8 mL水加熱至80℃，加入320 mg NOR（1 mmol/L），滴加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液至NOR溶解，再將80 mg 2-氯乙胺（1 mmol/L）緩慢加入，繼續(xù)攪拌反應30 min，反應過程中不斷滴加0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液使pH值保持在8.0。反應結(jié)束，待溫度降至60℃，用0.1 mol/L鹽酸將溶液pH調(diào)節(jié)至6.0以析出沉淀。將沉淀物抽濾，并用50 mL水洗滌，最終干燥后得到目的產(chǎn)物，命名為半抗原NOR-1，反應過程見圖1。

圖1 半抗原NOR改造為NOR-1的反應過程Fig.1 The process of hapten NOR transformation to NOR-1

1.2.2 完全抗原的制備與鑒定 將10 mg NOR-1溶解于3 mL二甲基甲酰胺中作為A液，再將20 mg BSA溶解于3 mL的PBS中作為B液。將A液與B液混合，加入30 μL 25%戊二醛，在4℃條件下混勻攪拌4 h，再加入1 mL 15 mg/mL的硼氫化鈉，4℃避光攪拌2 h，反應產(chǎn)物透析3 d（透析袋分子量為8000～14 000 kDa），得到免疫原（NOR-1-BSA）。按照同樣的方法，以OVA作為蛋白載體，進行包被抗原（NOR-1-OVA）的制備，最終在220～400 nm范圍內(nèi)，使用紫外掃描鑒定是否偶聯(lián)成功。制備過程見圖2。

圖2 NOR-1-BSA完全抗原的合成過程Fig.2 The synthesis process of complete antigen NOR-1-BSA

1.2.3 抗FQs 單克隆抗體（McAb）的制備 選擇經(jīng)完全抗原免疫的小鼠中血清效價及對藥物的半數(shù)抑制量（half maximal inhibitory concentration，IC50）俱佳的小鼠進行單克隆抗體的制備。在無菌條件下取小鼠脾臟，獲取脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合，制備雜交瘤細胞。以NOR-1-OVA作為包被原，應用間接ELISA的方法，根據(jù)效價及IC50篩選出陽性雜交瘤細胞，并擴大培養(yǎng)。將擴大后的細胞注射入小鼠腹腔內(nèi)，以體內(nèi)誘生腹水瘤法，制備單克隆抗體。將腹水離心取上清液，用HiTrapTMProtein G純化柱純化抗體，測定純化后抗體效價及IC50。

1.4 抗FQs的McAb-HRP的合成與鑒定 參考熊挺等[25]方法，采用改良過碘酸鈉法合成抗FQs單克隆抗體辣根過氧化物酶標記物。稱取3 mg HRP溶解于0.6 mL去離子水中，再加入200 μL NaIO4溶液（0.1 mol/L），混勻，室溫避光反應20 min。將反應后的混合液使用NaAc溶液（1 mmol/L，pH4.4）透析過夜，透析后的HRP溶液用CBS（碳酸鹽緩沖液0.2 mol/L，pH9.5）調(diào)節(jié)至pH9.5作為A液。取3 mg FQs-McAb（氟喹諾酮類藥物單克 隆抗體）溶于CBS（0.01 mol/L，pH9.5）中作為B液，將A液與B液混合，室溫避光輕微振蕩反應2 h。將40 μL NaBH4溶液（4 mol/L），混勻，室溫避光反應1.5 h。將最終反應產(chǎn)物以PBS溶液（0.01 mol/L, pH7.4）于4℃透析3 d，與等體積甘油混合保存于-20℃。取部分產(chǎn)物在220～400 nm范圍進行紫外掃描鑒定是否偶聯(lián)成功。

1.5 dc-CLEIA檢測步驟 包被：用CBS（pH9.6，0.05 mol/L）將包被原NOR-1-OVA稀釋加入化學發(fā)光板中100 μL/孔，4℃孵育過夜，1×PBST洗板3遍，間隔5 min。封閉：封閉液200 μL/孔，37℃孵育1.5 h，1×PBST洗板3遍，間隔5 min。加抗體及競爭物：洗板后加入50 μL稀釋好的標準品（或樣品）和50 μL FQs酶標抗體，置于37℃孵育1 h，1×PBST洗板3遍，間隔5 min。顯色：加入100 μL/孔的化學發(fā)光的底物液（A液：B液=1∶1），5 min內(nèi)以檢測儀讀取相對光單位值（relative light unit，RLU），檢測流程示意圖見圖3。

圖3 直接競爭化學發(fā)光酶免疫法檢測流程示意圖Fig.3 Schematic diagram of dc-CLEIA reaction

1.6 dc-CLEIA的建立

1.6.1 dc-CLEIA的條件優(yōu)化 采用棋盤法對包被原濃度和酶標抗體稀釋度進行初步選擇。以NOR-1-OVA作為包被原，將包被原和酶標抗體進行梯度稀釋，選擇RLU值在1.0×105的抗原包被濃度和酶標抗體稀釋濃度為初步選擇的濃度。在初步選擇的包被抗原濃度及抗體濃度上下范圍內(nèi)，選擇3個包被濃度及3個抗體稀釋濃度進行二因子交叉試驗，以20、10、5、2.5、1.25、0.625和0 ng/mL NOR作為競爭標準品進行競爭反應，按1.5的檢測步驟進行操作，每組試驗重復3次。根據(jù)測定結(jié)果計算出各組合條件下的IC50，選出最佳包被原濃度和酶標抗體稀釋度。

通過控制單因素變量試驗來確定最佳包被方法、封閉液種類、競爭時間。分別設置3組包被條件：37℃ 2 h、37℃ 4 h、4℃過夜；分別設置3組不同的封閉條件：1%脫脂乳、1%明膠、1%牛血清蛋白（BSA）；分別設置3組競爭時間：30 min、60 min、90 min。按照1.2.4中所述的方法進行競爭化學發(fā)光操作，測定RLU值，每個條件重復3次，計算各條件下的IC50和RLUmax。根據(jù)測定的條件繪制標準曲線，以IC50和RLUmax/IC50作為依據(jù)，RLUmax/IC50比值越大，IC50越小，則在該條件下靈敏度越高，越符合試驗的最佳要求[26]。

1.6.2 NOR的dc-CLEIA建立

1.6.2.1 標準曲線 根據(jù)上述優(yōu)化后的最佳反應條件，將藥物標準品用0.01 mol/L的PBS（pH7.4）梯度稀釋為20、5、1.25、0.3125、0.07 825 ng/mL的系列濃度的標準品和PBS稀釋液作空白對照進行競爭抑制，測定RLU值，每個濃度做3組平行重復。根據(jù)測量的結(jié)果，以Log（C）為橫坐標，以B/B0（%）為縱坐標，建立標準曲線。

1.6.2.2 特異性試驗 選取12種氟喹諾酮類藥物，對藥物進行梯度的稀釋，以優(yōu)化后的條件進行dc-CLEIA，根據(jù)結(jié)果擬合抑制曲線計算IC50，并計算出抗體對于氟喹諾酮類藥物的交叉反應率（CR）：

1.6.2.3 精密性試驗 以不同濃度的NOR標準品進行競爭抑制時酶標抗體與抗原結(jié)合率的批內(nèi)誤差和批間誤差來評價該方法的精密度。同一次試驗中每一濃度標準品做3次重復測定，以其批內(nèi)變異系數(shù)（CV）表示批內(nèi)精密度。在不同時間進行3次連續(xù)試驗，以其批間變異系數(shù)表示批間精密度。

1.6.2.4 最低檢出限試驗 用CLEIA方法測定20個標準空白孔（50 μL PBS+50 μL酶標物），計算出20個標準空白孔的RLU的平均值（）和標準差（SD），代入公式Z=-3SD，根據(jù)標準曲線計算出Z值對應的NOR濃度，即為最低檢出限。

1.7 其他FQs的dc-CLEIA主要參數(shù) 選擇NOR廣譜特異性抗體能夠識別的除NOR以外的FQs，參照1.6.2.1分別對各藥物梯度進行稀釋，測定dc-CLEIA，建立各藥物標準曲線。此外進行最低檢出限試驗，并匯總能夠被NOR廣譜特異性抗體識別的FQs的dc-CLEIA主要參數(shù)。

1.8 樣品處理 取1 mL待檢牛奶樣品于15 mL離心管中，加入乙腈-10%三氯乙酸溶液4 mL，超聲5 min，于4℃、4000 ×g離心10 min取上清液[17]。為消除基質(zhì)效應對試驗結(jié)果的影響，將上清液以PBS為稀釋液稀釋20倍后用于dc-CLEIA的測定。

1.9 添加回收率試驗 選取與本試驗制備抗體交叉反應率較高的十種氟喹諾酮類藥物，分別向經(jīng)色譜檢測的陰性牛奶樣品其中添加藥物，使各藥物終濃度20、10 ng/mL，每個濃度設 3 個平行。按照1.8中對牛奶樣品處理的方法，用直接競爭 CLEIA 方法測定樣品中藥物濃度，并計算回收率和變異系數(shù)?；厥章剩?）=（實際濃度的平均值/添加濃度）×100%，變異系數(shù)CV（%）=（實際濃度的標準差/實際濃度的平均值）×100%。

2 結(jié)果

2.1 完全抗原的鑒定 取NOR-1、NOR-1-BSA、BSA，以PBS溶液溶解，在200～400 nm范圍進行紫外掃描，確定各物質(zhì)的最大吸收峰，紫外掃描結(jié)果見圖4。NOR-1波長在272 nm處及323 nm處分別有吸收峰，BSA在277 nm處有最大吸收峰，偶聯(lián)后產(chǎn)物NOR-1-BSA在279 nm及324 nm處有最大吸收峰，偶聯(lián)后產(chǎn)物吸收峰相對于NOR-1及BSA最大吸收峰發(fā)生了偏移，且NOR-1-BSA同時具備了NOR-1及BSA的峰值特征，可以確定NOR-1與蛋白載體BSA偶聯(lián)成功。

圖4 NOR-1-BSA完全抗原紫外掃描圖譜Fig.4 Completed antigen UV spectra of NOR-1-BSA

2.2 酶標抗體McAb-HRP的鑒定 由圖5可見FQs-McAb的特征吸收峰在276 nm，HRP的特征吸收峰在403 nm，McAb-HRP在278 nm和402 nm處分別存在吸收峰，兼具FQs-McAb和HRP的特征，且與FQs-McAb和HRP的特征峰值相比，吸收峰發(fā)生了偏移，說明McAb-HRP偶聯(lián)成功。

圖5 抗FQs的McAb-HRP紫外鑒定掃描圖譜Fig.5 McAb-HRP UV identification scanning map of anti-FQs

2.3 抗FQs廣譜特異性單克隆抗體的制備 對融合后的陽性孔，以藥物NOR作為競爭標準品，以間接競爭ELISA對細胞株進行二次篩選，選擇效價高且對于藥物抑制效果好的細胞進行3次亞克隆，最終篩選出的陽性細胞株7B6所制備的抗體效價達到了1∶4.0×105，對于藥物（NOR）的IC50為1.4 ng/mL。

2.4 最佳反應條件的確定

2.4.1 包被原與酶標抗體稀釋度的確定 通過棋盤法初步選擇RLU值在1×105的包被原濃度及抗體稀釋濃度，然后在上下范圍內(nèi)選擇包被原濃度為0.6、0.3、0.15 μg/mL，選擇酶標抗體的濃度為1∶6000、1∶8000、1∶10 000進行競爭反應。由表1可見，當包被原為0.3 μg/mL，酶標抗體稀釋度為1∶8000時，其IC50最小為2.13 ng/mL，表示該稀釋度配比下的競爭反應最為靈敏，故選擇包被原為0.3 μg/mL，酶標抗體稀釋度為1∶8000為最優(yōu)組合。

表1 不同稀釋度包被原和酶標抗體反應的IC50Table 1 The IC50 values of different dilutions of coating antigen and enzyme-labeled antibody

2.4.2 包被條件的確定 由圖6可見，在3種包被條件下，IC50逐步升高，RLUmax/IC50逐步降低。第三組（4℃過夜）的IC50最低，而RLUmax/IC50最高，表明將包被原在4℃過夜的情況下，可使抗原包被的更加均勻、完全，同時可以使檢測的靈敏度提高。最終選擇4℃過夜為最佳的包被條件。

圖6 NOR CLEIA包被條件優(yōu)化Fig.6 Optimization of coating conditions for dc-CLEIA of NOR

2.4.3 封閉液的確定 由圖7可見，1%BSA封閉時的IC50最低，其中1%BSA和1%明膠封閉的IC50接近，但1%BSA封閉時的RLUmax/IC50最高。因此綜合考慮IC50和RLUmax/IC50，最終選擇1%BSA為最佳封閉條件。

圖7 封閉液種類的優(yōu)化Fig.7 Optimization of the type of blocking buffer

2.5 NOR的dc-CLEIA建立

2.5.1 建立標準曲線 通過對梯度稀釋的不同濃度NOR，進行dc-CLEIA，以LgC（NOR）為橫坐標，以B/B0為縱坐標建立標準曲線如圖8，得出LgC與B/B0呈線性關(guān)系，方程為y= -0.2554x+0.542，R2=0.9933，IC50=1.46 ng/mL。

圖8 NOR藥物的標準抑制曲線Fig.8 Standard inhibition curve of NOR

2.5.2 競爭時間的確定 由圖9可見，隨著競爭反應時間的增加，IC50先降低后升高，在反應時間為1 h時最低；對于RLUmax/IC50，隨著時間的增加，其數(shù)值先升高后降低，1 h時達到最高。由此選擇1 h作為競爭反應時間。

圖9 競爭時間的優(yōu)化Fig.9 Optimization of competitive reaction

2.5.3 特異性試驗 以dc-CLEIA法，求出各藥物的IC50，得出該方法對10種氟喹諾酮類藥物的靈敏度。由表2可知，NOR廣譜特異性抗體對10種氟喹諾酮類藥物的有較好的交叉反應，其交叉反應率范圍為12.6%～118.9%，但對二氟沙星、沙拉沙星的交叉反應均小于1%，與其他非喹諾酮類藥物的無交叉反應率。

表2 dc-CLEIA法測定對FQs藥物的交叉反應性Table 2 Cross-reactivity of FQs by dc-CLEIA

2.5.4 精密性試驗 以批內(nèi)和批間變異系數(shù)表示CLEIA的精確度，NOR標準品的各濃度的結(jié)合率和變異系數(shù)見表3。按照檢測方法的變異系數(shù)公式CV（%）=[SD的平均值/(1.414×平均結(jié)合率)]×100%進行計算。CLEIA的批內(nèi)變異系數(shù)為：CV（%） = [3.9/ (1.414×51.7)]×100%=5.33%，CLEIA的批間變異系數(shù)為CV（%）= [4.5/ (1.414×50.4)]×100%=6.31%。由批內(nèi)和批間變異系數(shù)均低于10%可知，本方法重復性好。

表3 dc-CLEIA精密性試驗結(jié)果Table 3 The precision experiment results of dc-CLEIA

2.5.5 最低檢測限 由表4可知，20個空白孔平均值為145 055.45，SD為8025.42，代入公式Z=-3SD，Z=120 979.19，計算B/B0，經(jīng)標準曲線方程y=-0.2554x+0.542推算得知NOR最低檢測限為0.0719 ng/mL。其他FQs的dc-CLEIA主要參數(shù)見表5。

表4 空白樣品檢測結(jié)果Table 4 The results of blank sample by CLEIA

表5 dc-CLEIA法測定對FQs藥物的交叉反應性Table 5 Cross-reactivity of FQs by dc-CLEIA

2.5.6 回收率試驗 通過在牛奶中的添加回收試驗，分別加標濃度為20、10 ng/mL，以dc-CLEIA法分別求出加標濃度下的光度值RLU，每組進行3次重復取平均值，通過對于各種藥物建立的標準曲線，得出牛奶的回收濃度，求出樣品回收率為73.3%～103.1%。詳細結(jié)果見表6。

表6 dc-CLEIA的添加回收率試驗Table 6 Recovery experimentof dc-CLEIA

3 討論

本研究成功建立了一種能夠檢測10種氟喹諾酮類藥物殘留的化學發(fā)光酶免疫方法，該方法可以實現(xiàn)對10種氟喹諾酮類藥物的高通量檢測。制備具有氟喹諾酮類藥物（FQs）廣譜特異性的單克隆抗體是建立該方法的關(guān)鍵，故本研究設計選擇與FQs母核結(jié)構(gòu)較為相似的藥物諾氟沙星（NOR）來進行完全抗原的制備，通過在NOR的哌嗪環(huán)上連接一個碳鏈，再由碳鏈與蛋白載體進行連接，使得蛋白載體在空間上遠離藥物的母核結(jié)構(gòu)，既充分暴露母核結(jié)構(gòu)，又保證了母核結(jié)構(gòu)的完整性。經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，以完全抗原NOR-1-BSA免疫小鼠制備的單克隆抗體對氟喹諾酮類藥物具有廣譜特異性和較高的靈敏性。

為了彌補廣譜特異性的單克隆抗體應用于檢測時靈敏度的不足，本研究選擇了較傳統(tǒng)ELISA方法更為靈敏的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫法，通過對包被原與酶標抗體稀釋倍數(shù)、封閉液種類、競爭時間等條件進行優(yōu)化建立了dc-CLEIA方法，將化學發(fā)光的靈敏性與單克隆抗體的特異性結(jié)合起來，可以實現(xiàn)對于氟喹諾酮類藥物殘留更高靈敏度的檢測[27]，其中該方法對于10種藥物的靈敏度（IC50）在1.46～11.57 ng/mL，檢測限在0.07～0.27 ng/mL之間。Jang等[28]建立的ELISA方法，可檢測13種氟喹諾酮類藥物，其檢測限為2.4 ng/mL；Barreto等[29]建立的液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)的方法能夠檢測9種FQs藥物，其檢測限為5 ng/mL；Zhu等[17]建立的氟喹諾酮類藥物的膠體金檢測技術(shù)的檢測限為25 ng/mL。綜上，本研究建立的方法在檢測限上可達到甚至優(yōu)于與其他檢測方法。

dc-CLEIA方法無需孵育酶標二抗，簡化了操作步驟，而且經(jīng)過酶和發(fā)光兩級放大效應使得檢測范圍更寬。在模擬樣本檢測中，本方法對于10種氟喹諾酮類藥物的檢測回收率為73.3%～103.1%，且對這些藥物的檢測限均在國家規(guī)定的最高殘留限度之下，說明該方法具有較強的可靠性及實際應用價值，可滿足10種氟喹諾酮類藥物殘留的高通量檢測需求。