夏銀河，周 峰，陳 陸，王新衛(wèi)，李永濤，史姿聰，劉紅英，常洪濤，楊 霞，王川慶

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450002）

蓋他病毒（Getah virus，GETV）為單鏈正股RNA病毒，屬于披膜病毒科甲病毒屬成員，1955年由美國陸軍醫(yī)學(xué)研究部門從馬來西亞的雪背庫蚊（C.gelidus）中分離并命名，原型株為MM2021[1-2]。自發(fā)現(xiàn)以來，在歐洲、亞洲、大洋洲的不同動(dòng)物中均發(fā)現(xiàn)GETV的存在，其傳染性和致病性受到廣泛關(guān)注；目前國內(nèi)已在哺乳動(dòng)物（豬、狐貍、馬和牛）中分離到多株GETV毒株[3-6]，且在商品化動(dòng)物疫苗以及公豬精液中也有發(fā)現(xiàn)[4,7]。然而其在豬群中的流行態(tài)勢和危害程度尚不明確，目前國內(nèi)還沒有針對該病毒的血清學(xué)診斷和調(diào)查的商品化的抗體檢測試劑盒。因此建立一種特異有效、可用于大面積快速檢測的ELISA檢測方法對于該病毒的研究具有重要意義。

GETV病毒顆粒呈球形，有囊膜和纖突，直徑約70 nm[8]；基因組大小為11 000～12 000 bp，含有兩個(gè)開放閱讀框（open reading frame，ORF），編碼4個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1、NSP2、NSP3、NSP4）和5個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，包括Cap、E3、E2、6K、E1蛋白，其中Cap蛋白是病毒粒子形成和存活所必須的元件[5,9]。

近年來，我國多數(shù)地區(qū)均檢測到蓋他病毒感染并呈上升趨勢，病毒分離地幾乎跨越我國全境（從北緯19°至46°18'）。宿主范圍不斷擴(kuò)大（我國流行宿主新增豬、狐貍、馬和牛），對我國的養(yǎng)殖業(yè)形成潛在威脅。目前雖尚無人類臨床發(fā)病的報(bào)道，但在健康人和發(fā)熱病人血清中均檢測到蓋他病毒中和抗體[10-11]，一般認(rèn)定其為人獸共患病病毒[12]。結(jié)合全球流行趨勢和我國的流行情況，該病毒近年在我國存在暴發(fā)的可能性。因此，本文對Cap蛋白序列進(jìn)行擴(kuò)增，原核表達(dá)Cap融合蛋白，將其作為包被抗原，建立了檢測GETV IgG抗體的間接ELISA方法，旨在為我國豬群內(nèi)GETV流行情況的檢測和疫苗免疫效果的評判提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和樣品來源 GETV HNJZ-SI株、病毒RNA提取試劑盒（DP315-R）購自天根生化科技（北京）有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒購自生工生物（上海）股份有限公司；Gel-Extraction Kit（D2500-02）購自美國Omega Bio-Tek公司；HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；pMDTM18-T Vector Cloning Kit、DL1000 DNA marker均購自TaKaRa公司；2×RapidTaqMaster Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物有限公司；羊抗豬IgG-HRP抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；TMB底物顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自博士德生物工程有限公司；預(yù)染蛋白Marker購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Gel-Extraction Kit（D2500-02）購自美國Omega Bio-Tek公司；DNA marker購自TaKaRa公司；CSFV、PRRSV、FMDV、Mhp和PCV2陰性、陽性血清由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。119份臨床血清樣品來源于陜西省、河南省、山東省等豬場，由本實(shí)驗(yàn)室收集保存（其中含有20份已由中和試驗(yàn)判定為GETV抗體陽性的血清樣品）；大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物有限公司；Thermo MULTISKAN GO全波長酶標(biāo)儀為賽默飛世爾科技（中國）有限公司產(chǎn)品。

1.2 Cap蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 參考GenBank中豬源毒GETV（HNJZ-SI, KY363862.1）Cap基因，使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并插入酶切位點(diǎn)EcoRⅠ和XholⅠ，F(xiàn)：5'-CGCgaattcATGAATTACA TTCCAACT-3'；R：5'-CTCctcgagCCATTCTTCTG TTCCTTC-3'；以HNJZ-S1毒株的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，與pET-28a載體進(jìn)行雙酶切連接，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-Cap。重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，同時(shí)送生工生物工程（上海）股份有限公司測序鑒定。

1.3 GETV Cap蛋白的制備與鑒定 將重組質(zhì)粒pET28a-Cap轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落在LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，取適量菌液1∶100接菌，菌液培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，用終濃度為0.1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化蛋白，Western blot鑒定并測定蛋白濃度后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 間接ELISA方法的建立與反應(yīng)條件的優(yōu)化 采用方陣滴定法，確定間接ELISA的Cap蛋白最佳抗原包被濃度（10 μg/mL、5 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL、0.0625 μg/mL），最佳血清稀釋度（1∶50、1∶100、1∶200、1∶4 0 0），最佳二抗稀釋度（1∶1 0 0 0、1∶2000、1∶4000、1∶8000），最佳包被液為0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（CBS、PBS、Tris、咪唑、生理鹽水），封閉時(shí)間（1 h、1.5 h、2 h、2.5 h），孵育時(shí)間（30 min、45 min、60 min、75 min、90 min），顯色時(shí)間（5 min、10 min、15 min、20 min）。

1.5 臨界值的確定 利用IFA方法篩選陰性血清30份，按優(yōu)化后的間接ELISA方法檢測陰性血清，并設(shè)立陰性對照和陽性對照。將每份血清間接ELISA的OD450值轉(zhuǎn)換為抗體效價(jià)（S/P），即（待檢血清OD450值-陰性血清OD450值）/（陽性血清OD450值-陰性血清OD450值），計(jì)算抗體效價(jià)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)方差SD。當(dāng)樣品S/P值＜+2SD時(shí)，判為陰性；當(dāng)樣品S/P值＞+3SD時(shí)，判為陽性；介于二者之間，判為疑似，需進(jìn)行再次檢驗(yàn)，如果S/P值仍小于+3SD時(shí)則判為陰性。

1.6 特異性試驗(yàn) 利用建立的間接ELISA方法對本實(shí)驗(yàn)室制備的CSFV、PRRSV、FMDV、TGEV和PCV2陽性血清進(jìn)行檢測，并設(shè)立GETV陽性、陰性血清對照，每份樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。利用酶標(biāo)儀檢測OD450值，依據(jù)陰、陽性臨界值，判定其陰性和陽性，評估該方法的特異性。

1.7 敏感性試驗(yàn) 將GETV陽性血清倍比稀釋（1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1600），按已建立的間接ELISA方法操作，利用酶標(biāo)儀檢測OD450值，依據(jù)陰性、陽性臨界值進(jìn)行判定，評估該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn) 使用同批表達(dá)純化的Cap蛋白包被酶標(biāo)板，按已建立的間接ELISA方法操作。隨機(jī)選取陽性血清8份，每份血清重復(fù)6孔，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；以不同批次表達(dá)純化的Cap蛋白作為包被抗原，對此8份血清進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.9 符合性試驗(yàn) 利用本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法與金標(biāo)準(zhǔn)IFA方法對來源于陜西省、河南省、山東省等地119份豬血清樣品進(jìn)行檢測，計(jì)算兩種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pET28a-Cap的鑒定 對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET28a-Cap分別采用PCR、EcoRⅠ/XholⅠ雙酶切和EcoRⅠ單酶切鑒定，PCR結(jié)果顯示出1條約804 bp的特異性條帶，雙酶切結(jié)果出現(xiàn)兩條特異性條帶，分別為5369 bp和804 bp。單酶切結(jié)果顯示，特異性條帶約為6317 bp，均與預(yù)期片段大小一致；經(jīng)測序結(jié)果正確，表明重組質(zhì)粒pET28a-Cap正確構(gòu)建。

2.2 Cap蛋白的鑒定 以PCR擴(kuò)增獲得Cap基因后構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-Cap，轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)，純化Cap蛋白與載體標(biāo)簽形成的融合蛋白約為35 kDa，蛋白濃度為724 μg/mL（圖1）。

圖1 Cap蛋白純化的SDS-PAGE及Western blot鑒定Fig.1 SDS-PAGE and Western blot analysis of purification of GETV Cap

2.3 間接ELISA檢測方法的最佳反應(yīng)條件 矩陣試驗(yàn)結(jié)果顯示，Cap蛋白最佳包被濃度為2 μg/mL，血清最佳稀釋倍數(shù)為100倍，抗原最佳包被條件為CBS 4℃包被過夜，37℃條件下IgG-HRP（1∶2000）最佳反應(yīng)時(shí)間為反應(yīng)1 h，TMB底物最佳作用時(shí)間為15 min（表1）。

表1 間接ELISA檢測方法最佳反應(yīng)條件Table 1 Optimized conditions of indirect ELISA

2.4 臨界值的確定 使用優(yōu)化后的反應(yīng)條件檢測40份GETV陰性血清樣品，按照公式：血清樣本抗體效價(jià)（S/P）=（OD450樣品-OD450陰性）/（OD450陽性-OD450陰性）確定每份樣品的抗體效價(jià)。分別計(jì)算其平均值X為0.0698和標(biāo)準(zhǔn)方差SD為0.0492，故陽性臨界值為0.2173，陰性臨界值為0.1681（圖2）。

圖2 臨界值的確定Fig.2 Determination of critical values

2.5 特異性良好 利用建立的間接ELISA方法對CSFV、PRRSV、FMDV、TGEV和PCV2陽性血清進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，其S/P值均低于陽性臨界值0.2173，該方法的診斷抗原Cap蛋白僅能與GETV陽性血清發(fā)生反應(yīng)，與其他幾種病毒陽性血清無交叉反應(yīng)（圖3）。表明本研究建立的間接ELISA方法具有良好的特異性。

圖3 間接ELISA特異性試驗(yàn)Fig.3 specificity test of indirect ELISA

2.6 敏感性較高 利用建立的間接ELISA方法對倍比稀釋的GETV陽性血清進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，當(dāng)血清640倍稀釋時(shí)S/P值仍大于0.2173，判定為陽性（圖4）。說明所建立的ELISA方法敏感性良好。

圖4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The results of sensitivity test

2.7 具有可重復(fù)性 利用建立的IgG抗體間接ELISA方法，選取8份不同效價(jià)的血清分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)，對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果顯示，批內(nèi)變異系數(shù)為0.96%～6.09%，批間變異系數(shù)為4.43%～11.76%，均小于12%（表2）。表明本研究建立的間接ELISA方法具有良好的重復(fù)性。

表2 間接ELISA 方法與IFA 符合性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of compliance test of ELISA and IFA

2.8 與IFA檢測結(jié)果的符合性較高 分別用建立的ELISA方法和IFA對陜西省、河南省、山東省等地的119份豬血清樣品進(jìn)行檢測，以IFA為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算間接ELISA與IFA的符合率。結(jié)果顯示，IFA檢出79份陽性，間接ELISA方法檢出76份陽性；IFA檢出40份豬蓋他病毒陰性，間接ELISA方法共檢出43份陰性。經(jīng)計(jì)算，間接ELISA方法和IFA的陽性符合率為96.2%，陰性符合率為100%，總符合率為97.5%。表明本研究建立的間接ELISA方法可用于臨床樣品檢測。

3 討論

當(dāng)前GETV在豬群的流行情況尚未完全明確，有研究表明，豬群在GETV的傳播過程中發(fā)揮重要作用[13-14]。自1964年在我國海南第一次發(fā)現(xiàn)GETV至今[15]，歷經(jīng)56年的流行和演變，其宿主范圍不斷擴(kuò)大，傳播區(qū)域越來越廣，進(jìn)一步增加了該病毒暴發(fā)流行的可能性，對我國的養(yǎng)殖業(yè)和公共安全均造成嚴(yán)重威脅。當(dāng)前已報(bào)道檢測GETV在豬群內(nèi)流行的血清學(xué)方法雖然較多，例如血凝抑制試驗(yàn)（haemagglutination inhibition assay，HI）、中和試驗(yàn)（serum neutralization test，SNT）及間接免疫熒光（indirect immunofluorescence assay，IFA）[16-17]等，這些方法雖然可靠，但均無商品化產(chǎn)品可供使用，而且這些方法操作繁瑣，耗時(shí)較長，且靈敏度和特異性尚有不足。因此，臨床生產(chǎn)上亟需一種操作方便，特異性好，靈明度高，穩(wěn)定可靠的方法來進(jìn)行豬群中GETV的流行病學(xué)調(diào)查和抗體水平的檢測，這將對開展GETV在我國的流行和分布，以及疫苗的研究具有重要意義。

甲病毒衣殼蛋白是形成病毒粒子中包裹病毒基因組的蛋白殼的元件，與病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)和感染性密切相關(guān)，而衣殼蛋白的構(gòu)象也決定了病毒包膜的裝配以及與包膜蛋白的相互作用，是主要的補(bǔ)體固定抗原，與病毒的復(fù)制和存活密切相關(guān)[9,18]。自然狀態(tài)下，GETV可引起妊娠母豬繁殖障礙和仔豬震顫、腹瀉、后肢麻痹、體表發(fā)紅等癥狀，嚴(yán)重者出現(xiàn)神經(jīng)癥狀或呈犬坐姿勢，甚至導(dǎo)致死亡[19-21]。疫苗免疫是臨床中應(yīng)對病毒性疾病的主要防控手段，IgG抗體是動(dòng)物機(jī)體抵抗外部感染的主要抗體，在血清中含量最高，在機(jī)體的再次免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，是反映機(jī)體免疫水平的重要指標(biāo)。間接ELISA方法因其耗時(shí)短、敏感性高、操作簡便、無需特殊儀器設(shè)備，且可用于特異性抗體檢測的特點(diǎn)，在臨床上廣泛使用[22-23]。因此，本研究以Cap蛋白為診斷抗原建立特異性IgG抗體間接ELISA檢測方法，為有效監(jiān)測豬群中GETV的感染情況和臨床中疫苗免疫效果的評測提供技術(shù)手段。成功構(gòu)建pET28a-Cap重組質(zhì)粒，利用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得融合蛋白，并通過鎳柱進(jìn)行親和層析純化獲得高濃度、高純度的目的蛋白；Western blot和活性檢測結(jié)果顯示，該蛋白特異性好、生物活性高，為ELISA檢測方法的建立奠定基礎(chǔ)。由于His標(biāo)簽的存在，因此所獲得的蛋白大小略高于預(yù)期。

本研究以純化的Cap蛋白為包被抗原，以羊抗豬lgG-HRP為二抗，采用矩陣法對間接ELISA反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳反應(yīng)條件，成功建立了檢測GETV血清IgG抗體的間接ELISA方法。各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法不僅特異性強(qiáng)，而且有良好的敏感性和可重復(fù)性，可用于豬群中GETV IgG抗體的檢測，為臨床上豬群GETV的抗體水平檢測和疫苗免疫效果評價(jià)提供了有效的檢測手段。對陜西省、山東省、河南省等119份送檢樣品進(jìn)行檢測（含20份經(jīng)RT-PCR方法[17]檢測陽性的樣品）。結(jié)果顯示，間接ELISA方法與IFA總符合率高達(dá)97.5%，略高于孟錦昕等[24]建立的滅活病毒檢測方法。另外，20份經(jīng)RT-PCR檢測陽性的樣品中，IFA檢測結(jié)果全部為陽性，間接ELISA結(jié)果也全部為陽性，符合率為100%；其余送檢樣品中檢出陽性樣品59份，陽性率達(dá)59.6%，遠(yuǎn)高于文獻(xiàn)報(bào)道的臨床樣品的陽性檢出率，分析原因發(fā)現(xiàn)，本研究抽取的臨床樣品均為2018年7-9月的送檢樣品，為當(dāng)年蚊蟲最活躍的季節(jié)，也是GETV的高發(fā)季節(jié)，而樣品選取存在偶然性，因此陽性率較高。本研究結(jié)果提示，GETV在豬群中的流行和感染情況不容樂觀，豬場等養(yǎng)殖單位有必要采取相應(yīng)措施減少豬群與蚊蟲接觸的機(jī)會(huì)，同時(shí)，研制出有效的疫苗也是控制GETV感染的關(guān)鍵。