楊 威，田 青,，趙興華，何 欣，趙志強(qiáng)，劉 月，段保寧，程 龍，鄭麗麗，李杰峰

（1.河北省畜牧獸醫(yī)研究所，保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，保定 071000；3.邯鄲市飼料工業(yè)辦公室，邯鄲 056002；4.邯鄲市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，邯鄲 056002）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是到目前已知最小的動(dòng)物病毒[1]，PCV屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為單股環(huán)狀DNA病毒?，F(xiàn)已知3個(gè)血清型，即PCV1、PCV2和PCV3。豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3）是一種新型的豬圓環(huán)病毒，于2015年在美國(guó)被發(fā)現(xiàn)，該病毒基因組長(zhǎng)2.0 kb[2]，同PCV1、PCV2相似，也包含兩個(gè)開放閱讀框（Rep和Cap）。已有研究表明，PCV3可能垂直傳播或?qū)е履肛i繁殖障礙[2-3]，美國(guó)學(xué)者Phan等[4]發(fā)現(xiàn)豬圓環(huán)病毒3型Rep蛋白編碼296aa，但其卻并非以ATG起始編碼，另外位于互補(bǔ)鏈上的Cap蛋白編碼231aa。

2016年，致病性的PCV3首次在我國(guó)被發(fā)現(xiàn)。目前，該病原在我國(guó)的8個(gè)省及1個(gè)直轄市均可以檢測(cè)到。豬圓環(huán)病毒3型感染以后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)障礙，引起免疫疾病、繼發(fā)感染等。PCV3在國(guó)內(nèi)外已逐漸呈現(xiàn)流行的趨勢(shì)，給生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成相當(dāng)大的經(jīng)濟(jì)損失。目前國(guó)內(nèi)尚缺乏豬圓環(huán)病毒3型的快速檢測(cè)方法，因此，建立一種針對(duì)豬圓環(huán)病毒3型快速的檢測(cè)方法具有重要意義。本研究針對(duì)PCV3建立快速檢測(cè)方法，為PCV3檢測(cè)、流行病學(xué)監(jiān)測(cè)以及發(fā)病機(jī)理的研究提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 病料及陽(yáng)性模板 本實(shí)驗(yàn)采用的豬圓環(huán)病毒3型陽(yáng)性病料為來自本實(shí)驗(yàn)室保存的樣本。豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）、偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）陽(yáng)性核酸均來自于本實(shí)驗(yàn)室。特異性實(shí)驗(yàn)所用豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV)、高致病性豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒（Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV）陽(yáng)性模板均為實(shí)驗(yàn)室保存的陽(yáng)性核酸。臨床樣品共157份，來自2018年河北地區(qū)6個(gè)豬場(chǎng)送檢的待檢淋巴結(jié)組織。

1.2 儀器 LifeECO基因擴(kuò)增儀購(gòu)自杭州博日科技有限公司；JY300型電泳儀購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自西盟國(guó)際集團(tuán)；K5500超微量分光光度計(jì)購(gòu)自北京凱奧科技發(fā)展有限公司；熒光定量PCR儀購(gòu)自卡尤迪生物科技（北京）有限公司。

1.3 試劑 TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、D2000購(gòu)自天根生化科技有限公司；Gold view核酸染色劑購(gòu) 自酷來搏科技有限公司；2×TaqMaster Mix購(gòu)自近岸蛋白質(zhì)科技有限公司；TaqMan熒光定量試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN生化科技有限公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 通過檢索GenBank上發(fā)表的豬圓環(huán)病毒3型序列，用DNAStar軟件比對(duì)，選取基因保守區(qū)域，用NCBI在線引物設(shè)計(jì)程序進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。參考豬圓環(huán)病毒3型毒株為PCV3 strain 29160（GenBank登錄號(hào)：KT869077.1），引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列為F：5'-TTGTGGTGCTACGAGTGTCC-3'；R：5'-CGTCTCCGTCAGAATCCGAG-3'。

1.5 PCV3目的基因擴(kuò)增與鑒定 依照組織DNA提取試劑盒操作說明對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。PCR反應(yīng)體系為：PCR mix 10 μL，正、反向引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.6 PCV3測(cè)序驗(yàn)證 收集擴(kuò)增出的PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，用DNAStar軟件比對(duì)所得核酸序列與GenBank中收錄的PCV3序列的同源性。

1.7 PCR特異性試驗(yàn) 分別取本實(shí)驗(yàn)室保存的7種豬常見病原核酸的陽(yáng)性模板與提取的豬圓環(huán)病毒3型DNA陽(yáng)性模板用以上引物同時(shí)做PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)。

1.8 PCR敏感性試驗(yàn) 對(duì)提取的豬圓環(huán)病毒3型DNA檢測(cè)核酸濃度進(jìn)行10-1～10-8稀釋，取1 μL作為模板，用本研究建立的PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取3份陽(yáng)性病料分別提取DNA，采用本研究建立的PCR檢測(cè)方法分別對(duì)這3份陽(yáng)性模板進(jìn)行擴(kuò)增，各重復(fù)擴(kuò)增3次，重復(fù)多孔同步驗(yàn)證重復(fù)性。

1.10 臨床樣品檢測(cè) 對(duì)2018年來自河北地區(qū)6個(gè)豬場(chǎng)送檢的157份待檢淋巴結(jié)組織樣品，采用本研究建立的PCR方法對(duì)PCV3進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)利用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)該樣品進(jìn)行PCV2、PRV、CSFV、HP-PRRSV、FMDV快速檢測(cè)。驗(yàn)證兩種檢測(cè)PCV3與其他豬常見病原是否存在混合感染現(xiàn)象，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析討論。

2 結(jié)果

2.1 PCV3測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果 對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序的結(jié)果如下：5'-TTGTGGTGCTACGAGTGTCCTGAAGATA AGGACTTTTATTGTCATCCTATTCTAGGTCCGG AGGGAAAGCCCGAAACACAGGTGGTGTTTTAC GATAAACAACTGGACCCCGACCGAGTGGGAAT CTATTGTGGAGTGTGGAGGCAGTATAGCGAGA TACCTTATTATCGGCAAAGAGGTTGGAAAAAG CGGTACCCCACACTTGCAAGGGTACGTGAATT TCAAGAACAAAAGGCGACTCAGCTCGGTGAAG CGCTTACCCGGATTTGGTCGGGCCCATCTGGAG CCGGCGAGGGGGAGCCACAAAGAGGCCAGCG AGTATTGCAAGAAAGAGGGGGATTACCTCGAG ATTGGCGAAGATTCCTCTTCGGGTACCAGATCG GATCTTCAAGCAGCAGCTCGGATTCTGACGGA GACG-3'。將測(cè)得的序列輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，確定所得序列為豬圓環(huán)病毒3型序列，用DNAStar軟件比對(duì)所得核酸序列與GenBank中收錄的6條PCV3序列同源性，同源性達(dá)到99.8%～100%。

2.2 特異性檢測(cè)結(jié)果 按照建立的PCR方法分別對(duì)7種常見病原核酸（PPV、PRV、PCV2、CSFV、HPPRRSV、PEDV、FMDV陽(yáng)性核酸）進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，只有PCV3陽(yáng)性樣品擴(kuò)增出1條約418 bp的條帶，而另7種豬常見病原核酸的陽(yáng)性模板均無任何條帶擴(kuò)增（圖1）。

圖1 PCR特異性檢測(cè)Fig.1 Specificity test of PCR products

2.3 敏感性檢測(cè) 將提取的PCV3模板DNA進(jìn)行10-1～10-8倍稀釋后進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該方法能夠擴(kuò)增出PCV3模板DNA的最大稀釋度為10-5（圖2），即能夠擴(kuò)增的最低模板量為1.13×10-3ng/μL，表明該方法具有較好的敏感性。

圖2 PCR敏感性檢測(cè)Fig.2 Sensitiveness test of PCR products

2.4 重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果 用本研究建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)3份陽(yáng)性樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3份樣品均擴(kuò)增出了418 bp的目的條帶，結(jié)果均為陽(yáng)性，該方法重復(fù)性較好。

2.5 流行病學(xué)調(diào)查中PCV3檢測(cè)方法的應(yīng)用 用本研究建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)2018年來自河北地區(qū)的6個(gè)豬場(chǎng)送檢的157份待檢樣品進(jìn)行PCV3檢測(cè)，結(jié)果顯示25份樣品為陽(yáng)性，總陽(yáng)性率為15.92%（表1）。

表1 樣品PCV3檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 1 PCV3 test statistics of pig samples

采用熒光定量PCR方法對(duì)該樣品進(jìn)行PCV2與PRV的快速檢測(cè)，結(jié)果顯示6個(gè)豬場(chǎng)中4個(gè)為PCV2陽(yáng)性豬場(chǎng)，總樣本陽(yáng)性率為8.28%（表2）；PRV檢測(cè)陽(yáng)性豬場(chǎng)為5個(gè)，總樣本陽(yáng)性率為15.29%（表3）。同樣采用熒光定量PCR方法對(duì)CSFV、HP-PRRSV、FMDV進(jìn)行檢測(cè)，均未檢出陽(yáng)性樣本。

表2 樣品PCV2檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 2 PCV2 test statistics of pig samples

表3 樣品PRV檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Table 3 PRV test statistics of pig samples

混合感染情況來看，多數(shù)PCV3和PRV感染都與PCV2混合感染，其中PCV2與PRV混合感染樣品共6份，占所有樣品的3.82%；PCV2與PCV3混合感染樣品共9份，占所有樣品的5.73%；未發(fā)現(xiàn)PRV與PCV3的混合感染；未發(fā)現(xiàn)PCV2、PCV3、PRV三重感染。

3 討論

2016年以來，Palinski等[2,4]相繼在美國(guó)不同地區(qū)的豬場(chǎng)檢出了PCV3，2017年Ku等[3-5]在福建、遼寧、廣東等11個(gè)省市發(fā)現(xiàn)豬群中存在PCV3感染，由此推測(cè)PCV3在國(guó)內(nèi)外已呈現(xiàn)逐漸流行的趨勢(shì)，但是目前國(guó)內(nèi)尚缺乏PCV3的快速檢測(cè)方法。傳統(tǒng)診斷病毒的方法有很多，例如間接ELISA、免疫組織化學(xué)，病毒分離技術(shù)等[4,6-9]，但間接ELISA技術(shù)需要制備特異性抗體，后兩個(gè)方法則需要苛刻的條件，PCR技術(shù)憑借其快速、特異、敏感和易于操作的優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于畜禽傳染病的檢測(cè)、鑒別診斷[5,10]。本研究為克服現(xiàn)有PCV3快速檢測(cè)手段的不足，提供了一種PCV3核酸的PCR檢測(cè)方法。該方法能夠擴(kuò)增的最低模板量為1.13×10-3ng/μL，與豬的7種常見病原核酸無交叉反應(yīng)情況，具有良好的敏感性、特異性和重復(fù)性，可以對(duì)PCV3進(jìn)行定性鑒別，從而為新型病毒豬圓環(huán)病毒3型的檢測(cè)和監(jiān)控提供有效方法。本研究建立的PCR檢測(cè)方法為豬圓環(huán)病毒3型的檢測(cè)及流行病學(xué)監(jiān)測(cè)、致病機(jī)理的研究提供技術(shù)支持。

利用本研究建立的PCR檢測(cè)方法，對(duì)來自河北地區(qū)的6個(gè)豬場(chǎng)送檢的157份待檢樣品進(jìn)行PCV3檢測(cè)，其中檢出陽(yáng)性樣本25份，陽(yáng)性率為15.92%，其中4個(gè)豬場(chǎng)中檢測(cè)到PCV3陽(yáng)性，兩地豬場(chǎng)的PCV3檢出率約為0%～60%，表明河北省部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒3型已經(jīng)流行，部分豬場(chǎng)感染嚴(yán)重，應(yīng)該提高警惕。

本次調(diào)查中所檢測(cè)的PCV3陽(yáng)性率為15.92%，高于2017年河北地區(qū)所報(bào)道的陽(yáng)性率[11]，但低于同時(shí)期報(bào)道的華南地區(qū)的PCV3檢測(cè)結(jié)果[12]。由此初步推測(cè)，PCV3流行情況隨時(shí)間推移呈現(xiàn)逐步加劇的情況。這與對(duì)于華東地區(qū)PCV3流行情況的調(diào)查結(jié)果相似[13-14]，華東地區(qū)PCV3的陽(yáng)性率從2011年到2017年間，陽(yáng)性率由4.1%升至35.0%，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)所采用的檢測(cè)方法與已報(bào)道的其他方法相比[15-16]，特異性試驗(yàn)中共檢測(cè)了7種豬病原核酸的陽(yáng)性模板，幾乎包括了所有常見的豬病病原。另外，應(yīng)用范圍擴(kuò)大至157份，對(duì)本方法進(jìn)行了充分的檢測(cè)應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)所用引物擴(kuò)增片段大小為418 bp，與已報(bào)道的其他檢測(cè)方法中的擴(kuò)增片段大小有所差異[11,13,17]，方便研究者根據(jù)不同的擴(kuò)增片段大小設(shè)計(jì)多重PCR檢測(cè)方法。

采用熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)157份樣品進(jìn)行PCV2與PRV快速檢測(cè)，結(jié)果顯示PCV2的陽(yáng)性率為8.28%，PRV的陽(yáng)性率為15.29%，其中PCV2與PCV3的混合感染率為5.73%，而PRV與PCV3不存在交叉感染。Ku等[3]采用普通PCR技術(shù)對(duì)來自遼寧、重慶的3個(gè)豬場(chǎng)中222份樣品進(jìn)行PCV2與PCV3的檢測(cè)結(jié)果顯示，PCV2陽(yáng)性率為62.2%，PCV3陽(yáng)性率為34.7%，兩者混合感染率為15.8%，這個(gè)結(jié)果與本研究中的結(jié)果相差較大，可能與地域、氣候等外界因素有關(guān)，也可能與養(yǎng)殖場(chǎng)PCV2免疫情況的差異有關(guān)。綜合本次檢測(cè)情況來看，PCV2與PCV3存在交叉感染，且多數(shù)PCV2感染伴隨PCV3感染，且兩者所引起的疾病癥狀極為相似，在針對(duì)PCV2的防治與研究工作中，應(yīng)特別注意是否存在PCV3的混合感染情況，防止由于PCV3的存在而影響對(duì)PCV2致病性的判斷。國(guó)內(nèi)對(duì)PCV2的致病機(jī)制與流行病學(xué)分析做了大量研究，但對(duì)PCV3的研究卻非常少，所以PCV3的致病機(jī)制及與其他病原體的混合感染情況是目前亟需研究清楚的問題，對(duì)PCV3流行病學(xué)的深入研究將有助于了解其致病特性和制定有效的防控手段，同時(shí)也可為解決PCV2與PCV3混合感染問題提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究建立了一種PCV3的PCR方法，該方法具有良好的特異性和敏感性。應(yīng)用該方法進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)部分豬場(chǎng)具有較普遍的PCV3感染情況。就本次檢測(cè)的樣本分析，PCV2與PCV3存在較普遍的交叉感染情況，應(yīng)引起重視。