盛 媛,朱蘊暖，劉 娜，劉存霞，于可響，胡 峰，郭效珍，李玉峰，劉麗萍，馬秀麗，黃 兵

（山東省農(nóng)業(yè)科學院家禽研究所 山東省禽病診斷與免疫重點實驗室 山東省家禽育種工程技術(shù)研究中心，濟南 250023）

鴨乙型肝炎病毒（Duck hepatitis B virus,DHBV），最早于1980年在北京麻鴨中被發(fā)現(xiàn)[1]，隨后德國和其他國家相繼報道[2-7]，DHBV與人乙肝病毒（Hepatitis B virus，HBV）同屬嗜肝DNA病毒科，其生物特性和發(fā)病機理與HBV類似，因此，鴨乙型肝炎動物模型常被用作抗HBV藥物篩選及HBV致病機理研究的重要動物模型之一[2,7]。由于鴨子感染DHBV后往往無明顯的臨床表現(xiàn)，多數(shù)呈隱性帶毒，并能導致持續(xù)性感染[8]。因此，迫切需要針對該病建立快速方便的檢測方法。

常規(guī)PCR方法雖然操作簡便，但靈敏度不高，巢式PCR、半巢式PCR雖然靈敏度較高，但是定量有一定難度，并不適合多樣本的檢測[9]。本研究根據(jù)鴨乙型肝炎病毒C基因保守區(qū)域設(shè)計一對特異性引物，建立了DHBV SYBR Green熒光定量PCR檢測方法，用于DHBV的定量檢測。該方法在臨床樣品的DHBV檢測，DHBV感染雛鴨的藥物動力學研究試驗中，更為節(jié)省時間，且操作簡便，靈敏度高。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 DHBV毒株LQM、鴨血清樣品，均由山東省禽病診斷與免疫重點實驗室分離保存。

1.2 主要試劑 SYBR Green Premix購自聚合美生物有限公司；核酸提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒等均購Genestar公司。

1.3 引物設(shè)計及合成 參照GenBank已發(fā)表的DHBV序列（GenBank登錄號：MF471769.1）比對分析，設(shè)計一對特異性引物，P1：5'-GCCTTAGC CAATGTGTATGA-3'，P2：5'-GGTGGAACA GGAGTAGTAGT-3'，引物由深圳華大基因公司合成，擴增片段大小為278 bp。

1.4 陽性標準品的制備 按照全式金Easypure@Viral DNA/RNA Kit說明書提取DHBV陽性血清中的病毒DNA。以提取的DNA為模板，用設(shè)計的引物進行PCR擴增。擴增條件為：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收純化后，連接至pMD-18T載體上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans 5α感受態(tài)細胞。篩選陽性重組質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)公司測序，鑒定正確的質(zhì)粒命名為pMD18T-DHBV。該質(zhì)粒作為陽性標準品，測定濃度并計算其拷貝數(shù)。

1.5 熒光定量PCR反應條件的優(yōu)化及標準曲線的建立 采用矩陣法分別對退火溫度（52、53、54、55、56、57℃）、引物濃度（終濃度分別為0.125、0.25、0.5、1 pmoL/μL）及模板量（1、2、3、4、5 μL）進行優(yōu)化試驗，確定熒光定量PCR最佳反應條件。將1.4制備的陽性標準品進行10倍梯度稀釋，以10-2～10-8梯度稀釋的質(zhì)粒為模板進行熒光定量PCR擴增，每個稀釋度做3個重復，建立標準曲線。

1.6 敏感性試驗 將提取的DHBV病毒DNA模板作10倍系列稀釋，用建立的熒光定量PCR進行擴增，驗證該方法的敏感性。

1.7 特異性試驗 分別提取鴨乙型肝炎病毒（DHBV）、鴨病毒性腸炎病毒（Duck viral enteritis virus，DCV）、Ⅰ型鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus typeⅠ，DHAV-Ⅰ）、鴨坦布蘇病毒（Duck Tambutsu virus，DTMUV）、鴨新型呼腸孤病毒（New duck reoviridae virus，NDRV）的DNA/RNA作為模板，用所建立的熒光定量PCR進行擴增，檢測該方法的特異性。

1.8 重復性試驗 將已知濃度的DHBV的核酸DNA進行10倍梯度稀釋，取7.8×108copies /μL、7.8×106copies /μL、7.8×104copies /μL 3個稀釋度為模板，每個濃度設(shè)3個重復，利用本試驗建立的熒光定量PCR方法進行組內(nèi)重復試驗；每個模板在相同條件下反復進行3次獨立的擴增，作為組間重復性試驗。根據(jù)Ct值分別計算平均數(shù)、標準差和變異系數(shù)，驗證該方法的重復性。

1.9 臨床應用 從山東省不同地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)鴨場采集的95份血清中提取病毒DNA，分別用建立的熒光定量PCR方法與常規(guī)PCR方法進行檢測，比較兩種方法的符合率。

1.10 DHBV感染雛鴨的動力學檢測 選取代表毒株LQM感染3日齡雛鴨6只，另設(shè)對照組6只，分別于感染后1、5、7、9、11、13、15、17、19、22、25、28和31 d脛靜脈采血，用建立的熒光定量PCR方法進行檢測，分析LQM毒株感染雛鴨的動力學變化情況。

2 結(jié)果

2.1 陽性標準品的制備 以DHBV陽性血清提取的病毒DNA為模板，擴增的目的片段與預期大小一致（圖1）。對構(gòu)建的重組質(zhì)粒進行測序，結(jié)果顯示成功構(gòu)建DHBV重組質(zhì)粒，命名為pMD18T-DHBV，作為陽性標準品。測定其濃度并換算成拷貝數(shù)為7.8×1010copies/μL。

圖1 DHBV DNA的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification of the DHBV DNA

2.2 SYBR Green熒光定量PCR最佳反應條件 最終確定優(yōu)化的反應體系20 μL：SYBR Green Premix 10 μL，上、下游引物（10 pmoL/μL）各0.5 μL，模板1 μL，滅菌ddH2O補足至20 μL。最佳反應條件：95℃預變性60 s；95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸20 s，40個循環(huán)。

2.3 標準曲線的建立及熔解曲線分析 用建立的SYBR Green熒光定量PCR方法檢測各梯度濃度的DHBV陽性標準品，該方法在7.8×108copies/μL～7.8×1 02copies/μL濃度范圍內(nèi)，呈 現(xiàn)良好的線性關(guān)系（圖2A），相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999，標準曲線方程為：y=-3.3925x+ 39.06，符合試驗預期。確定Ct值為36時，為臨界值。本試驗建立的qPCR對陽性重組質(zhì)粒的擴增產(chǎn)物溶解曲線顯示，在熔解溫度Tm為85.5±0.1℃時出現(xiàn)了唯一的特異性峰，無引物二聚體和非特異性擴增產(chǎn)物（圖2 B）。

圖2 qPCR方法的標準曲線（A）和熔解曲線(B)Fig.2 Standard curve (A) and melting curve (B) of the qPCR

2.2 敏感性試驗結(jié)果 利用建立的熒光定量PCR和普通PCR對10倍梯度稀釋的DHBV DNA模板進行檢測，已測定原始DHBV的DNA濃度為17.287 ng/μL，結(jié)果顯示，熒光定量PCR方法最低檢出1×105倍稀釋的模板，檢出量為1.73 pg；而普通PCR方法最低檢出103倍稀釋的模板，檢出量為173 pg（圖3）。

圖3 qPCR (A)與常規(guī)PCR (B)敏感性試驗結(jié)果Fig.3 Sensitivity of the qPCR (A) and PCR (B)

2.3 特異性試驗 利用建立的熒光定量PCR方法對DHBV、DCV、DHAV-1、DTMUV、N DRV進行檢測，結(jié)果顯示，除了DHBV為陽性外，其他病毒檢測結(jié)果均為陰性。說明該方法具有良好的特異性（圖4）。

圖4 特異性試驗熒光結(jié)果Fig.4 Amplification plot of the specificity assay

2.4 重復性試驗 選取3個不同濃度的質(zhì)粒標準品，利用熒光定量PCR方法進行組內(nèi)組間重復性試驗，結(jié)果顯示，組內(nèi)變異系數(shù)和組間變異系數(shù)均小于1.0%（表1）。表明本試驗建立的熒光定量PCR方法具有良好的重復性。

表1 qPCR的重復性試驗Table 1 The reproducibility test of the qPCR

2.5 臨床樣品的檢測結(jié)果 利用建立的熒光定量PCR方法對送檢的95份鴨血清進行檢測，同時與常規(guī)PCR方法進行比較。結(jié)果顯示，在95份樣品中，熒光定量PCR方法檢測有12份為DHBV陽性，常規(guī)PCR檢測有10份DHBV陽性，共同陽性數(shù)10份，共同陰性數(shù)83份，兩者的符合率為97.9%。

2.6 DHBV感染雛鴨的動力學檢測 在不同時間點采集感染LQM毒株后的雛鴨血清，利用建立的熒光定量PCR方法對其分別進行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LQM毒株感染雛鴨11 d時血清中病毒含量達到高峰，隨后逐漸下降，到25 d時又出現(xiàn)反彈上升（圖5）。

圖5 LQM毒株感染動力學曲線Fig.5 Infection kinetics curve of LQM strain

3 討論

傳統(tǒng)的PCR快速診斷方法因無法準確定量使其應用受到限制，而熒光定量PCR方法因具有操作簡便、靈敏度高、重復性好、可量化等優(yōu)點在病毒檢測方面得到廣泛應用[10-14]。由于DHBV的特殊地位，近年來DHBV的動物感染模型越來越受到關(guān)注。為實現(xiàn)DHBV的快速定量檢測，本研究根據(jù)DHBV C基因的保守區(qū)域設(shè)計一對特異性引物，建立了DHBV的SYBR Green實時熒光定量PCR檢測方法，旨在為該病的臨床檢測及流行病學研究提供幫助。

本研究建立的熒光定量PCR方法，擴增結(jié)果較為理想，標準曲線呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，熔解曲線峰值單一。組內(nèi)和組間的重復性變異系數(shù)均小于1%，表明建立的方法重復性好。建立的熒光定量PCR方法特異性好，僅能特異性地檢出DHBV，而不能檢出DCV、DHAV-2、DTMUV、NDRV等其他病毒。本研究建立的熒光定量PCR檢測方法的靈敏度高于普通PCR方法100倍。

為了將建立的熒光定量PCR方法盡快應用于臨床，更好地為臨床實踐服務，本研究對山東不同地區(qū)收集的95份樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，熒光定量PCR與常規(guī)PCR方法的符合率高達97.9%，且熒光定量PCR檢出率（12.6%）高于普通PCR（10.5%）。熒光定量PCR較普通PCR方法不僅減少了漏檢的可能性，同時又縮短了檢測時間，提高了檢測效率。此外，本研究又對DHBV感染雛鴨的動力學進行了研究，利用建立的方法對感染后不同時間的雛鴨體內(nèi)病毒含量進行檢測。檢測結(jié)果表明，DHBV感染雛鴨后，第11 d時病毒含量達到高峰，隨后逐漸下降，該試驗結(jié)果為藥物有效評價時間點的選擇提供了科學的理論依據(jù)。

本研究建立的SYBR Green熒光定量PCR檢測方法，不僅可實時進行數(shù)據(jù)分析，還能對檢測樣品進行病毒定量，為DHBV的早期監(jiān)測和定期普查提供了有效手段，也為今后開展DHBV的綜合防控及HBV藥物研發(fā)評價奠定了良好基礎(chǔ)。