提金鳳，李志杰，毛紅彥

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院，濰坊 261061）

鴨病毒性肝炎是雛鴨的一種急性、高度致死性傳染病，該病傳播速度快、病程短、病死率高[1]。臨床上，3周齡以內(nèi)的雛鴨多發(fā)，尤其是1周齡以內(nèi)雛鴨更易感，其發(fā)病率、死亡率可達90%～100%，給養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展造成嚴重危害[2]。

鴨病毒性肝炎的傳統(tǒng)分型中，該病有3種不同血清型的病原引起，分別是血清1型鴨肝炎病毒（DHV-1）、2型鴨肝炎病毒（DHV-2）和3型鴨肝炎病毒（DHV-3）[3]。隨著鴨病毒性肝炎的發(fā)生及新毒株的出現(xiàn)，關(guān)于鴨病毒性肝炎的分型有了新標準。2007年，Tseng等[4-5]分別在中國臺灣和韓國分離出與DHV-1沒有抗原相關(guān)性的新型DHV，命名為中國臺灣新型鴨肝炎病毒和韓國新型鴨肝炎病毒。2008年，Wang等[6]依據(jù)病毒的VPl、VP0、VP3基因序列及3D基因的部分序列，將DHV分為A、B、C3個基因型，分別對應DHV-1、中國臺灣新型和韓國新型。根據(jù)國際病毒分類委員會（ICTV）第九次分類報告[7]，DHV-1、中國臺灣新型鴨肝炎病毒、韓國新型鴨肝炎病毒分別定名為1型鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis A virus 1，DHAV-1）、DHAV-2和DHAV-3，其同屬于小RNA病毒目、小RNA病毒科、禽肝炎病毒屬成員。而原來傳統(tǒng)分型中的DHV-2和DHV-3則屬于鴨星狀病毒。流行病學調(diào)查顯示，2013年以來，DHAV-3已經(jīng)成為我國流行的主要血清型，由于該病毒引起的發(fā)病率和死亡率高，給集約化養(yǎng)鴨生產(chǎn)造成了嚴重的經(jīng)濟損失[8-9]。DHAV-3已成為影響我國養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展最主要的病原之一[10]。

本研究從山東濰坊某鴨場采集發(fā)病鴨病料進行鴨病毒性肝炎病原的分離鑒定及致病性試驗，以明確病原的種類、流行變化趨勢及致病特點，為臨床上更有效的防控該病提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 雞胚、實驗動物及試劑 9日齡SPF雞胚購自山東省農(nóng)科院SPF雞場，9日齡SPF鴨胚購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所，5日齡非免疫櫻桃谷鴨購自山東濰坊某種鴨場。RNAsimple總RNA提取試劑盒（DP419）、質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖械荣徸蕴旄萍迹ū本┯邢薰?，PCR mix、ddH2O等購自北京索萊寶科技有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒、SYBR Premix ExTaq、pMD18-T試劑盒、Random Premier等購自寶生物工程（大連）有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2 病毒分離 采集臨床發(fā)病雛鴨肝臟，稱重后按1∶4比例加無菌生理鹽水于勻漿器中勻漿，勻漿后的組織液凍融1～2次，12 000×g離心10 min，收集上清液。上清液經(jīng)0.22 μm細菌濾器過濾，濾液經(jīng)尿囊腔途徑接種9～11日齡SPF雞胚或鴨胚，0.2 mL/枚，對照組接種無菌生理鹽水。病毒在雞胚或鴨胚中盲傳3代，雞胚或鴨胚死亡時間穩(wěn)定在3～5 d，收集死亡雞胚或鴨胚尿囊液，-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病毒RT-PCR鑒定 根據(jù)GenBank中發(fā)布的DHAV-3 VP1基因序列（GenBank登錄號：KC191688.1）設計引物，上游引物為：5'-TACGCCAGCCACTCTCATCT-3'，下游引物為：5'-TGGTCAGGCACTGGCAAAT-3'，擴增片段大小為400 bp，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用RNAsimple總RNA提取試劑盒提取尿囊液中病毒總RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄，再進行PCR擴增。PCR擴增條件為：95℃預變性4 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行鑒定，膠回收產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。采用NCBI BLAST對測序結(jié)果分析比對。

1.4 VP1基因序列測定及分析 根據(jù)GenBank中發(fā)布的DHAV-3全基因序列和VP1基因序列（GenBank登錄號分別為MH752744.1、KC191688.1）設計擴增VP1蛋白全基因序列的引物，上游引物為：5'-AGGATTTTCAGTTTACAGCTC-3'，下游引物為：5'-CATTTCGAGATTGGTCTGAT-3'，擴增片段大小為798 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。將RT-PCR產(chǎn)物回收送測序。測序結(jié)果采用軟件DNAStar（version 7.10）、MEGA5.0與GenBank中發(fā)布的30株來自不同年代、不同地區(qū)的DHAV-3 VP1基因序列進行同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析。

1.5 病毒滴度測定 無菌PBS稀釋病毒，按照10倍梯度有限稀釋，每個稀釋度接種5枚9日齡SPF雞胚，觀察接種1～7 d雞胚的死亡情況，做好記錄，Reed-Muench法計算病毒的半數(shù)胚致死量（median embryo lethal dose，ELD50）。

1.6 動物試驗 20只5日齡SPF雛鴨平均分成2組，每組10只。A組為試驗組，采用滴鼻方式（模擬自然感染）接種DHAV-3病毒液，每只接種劑量為50 μL（該接種劑量通過預試驗確定）；B組為陰性對照組，每只接種50 μL無菌磷酸鹽緩沖鹽水。攻毒后3 d后，每組隨機選擇3只雛鴨安樂死，收集肝臟和脾臟，一部分組織樣品在10%緩沖福爾馬林溶液中固定，用于組織學檢查；另一部分貯存于-80℃冰箱中。

1.7 組織病理學檢查 組織樣品在10%福爾馬林溶液中固定48 h，經(jīng)不同濃度乙醇脫水，再經(jīng)二甲苯透明，使組織變硬、變脆。透明的組織塊在熔化的石蠟中停留1.5 h，再進行石蠟包埋，待蠟塊冷卻變硬后進行修整，放冰箱內(nèi)冷卻。組織塊經(jīng)切片機切成4 μm厚的切片，并按照染色程序采用蘇木精-伊紅（HE）染色，最后用中性樹脂封固鏡檢。

1.8 組織器官病毒載量的測定 取0.5 g冷凍組織勻漿，提取RNA。利用RNAsimple總RNA提取試劑盒提取各組織樣品的總RNA。通過分光光度計測定每個樣本總RNA的OD260和OD280值，確定RNA的濃度，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成1000 ng RNA的cDNA。利用SYBR GreenⅠ實時熒光PCR測定不同組織樣品中的病毒載量。該檢測方法以櫻桃谷鴨β-actin基因為內(nèi)參基因，DHAV-3 VP1基因為目的基因來測定DHAV-3 RNA在不同組織中的相對轉(zhuǎn)錄水平[11]。根據(jù)內(nèi)參基因β-actin（GenBank登錄號：EF571597）的基因序列設計引物，上游引物為：5'-CCATATACGAGGGCTACGC-3'，下游引物為：5'-AATGTCACGCACGATTTCC-3'，擴增片段大小為139 bp[11]。目的基因VP1（GenBank登錄號：KC191688.1）的上游引物為：5'-TATATCTG GACGCAATCAGG-3'，下游引物為：5'-TAAGTCT CAAACAGAAGCGAA-3'，大小為232 bp。兩對引物利用Oligo 7.0軟件進行設計。熒光定量PCR采用25 μL反應體系：12.5 μL 2×SYBR Green I Premix，2 μL cDNA模板，引物各0.5 μL（10 μmol/L），9.5 μL ddH2O。反應條件為：94℃預變性5min；94℃變性15 s，59℃退火60 s，35個循環(huán)。每個樣品重復3次。

1.9 數(shù)據(jù)分析 試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差（±S），組織病毒載量采用單向方差評估，利用SPSS 19.0和Graphpad Prism 5軟件進行t檢驗與單項方差分析。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離 病毒在SPF雞胚中生長良好，一般在接種病毒4～5 d死亡，死亡胚體水腫，頭部和頸部皮膚出血明顯，有的胚體肝臟顏色變黃，肝臟上有出血點或黃白色壞死斑塊（圖1）。

圖1 病毒接種后死亡的雞胚Fig.1 Chicken embryos died inoculation with DHAV-3

2.2 病毒的RT-PCR檢測 收集死亡雞胚的尿囊液，提取總RNA后進行RT-PCR擴增，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示在400 bp左右的位置出現(xiàn)目的條帶（圖2）。PCR產(chǎn)物回收測序，在GenBank中進行序列比對，結(jié)果該序列與GenBank中發(fā)布的DHAV-3序列同源性在99.0%以上，確定該病毒為DHAV-3，并命名為DHAV-3-SDWF株。

圖2 病毒的RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.2 The identification of RT-PCR about the virus

2.3 DHAV-1 VP1基因序列分析 采用Oligo 7.0軟件對DHAV-3-SDWF VP1基因的測序結(jié)果與GenBank上發(fā)布的25株分離自不同年代、不同國家和地區(qū)的DHAV-3 VP1基因序列進行比對分析，繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖3）。從進化樹上可以看出：2007～2020年分離鑒定的DHAV-3主要形成2大分支，也就是2種基因型，基因Ⅰ型和基因Ⅱ型，其中基因Ⅰ型又形成2個分支，即Ⅰa亞型分支和Ⅰb亞型分支。我國不同年代、不同地區(qū)出現(xiàn)的DHAV-3主要集中分布在基因Ⅰ型分支上，尤其是2012年以后DHAV-3分離株親緣性強，主要集中分布在Ⅰa亞型分支上；2012年以前分離的DHAV-3親緣性較強，主要集中分布在Ib亞型分支上。DHAV-3分離株在地域上沒有明顯的親緣性。DHAV-3系統(tǒng)發(fā)育進化樹的分析，為實際生產(chǎn)中DHAV-3弱毒苗或滅活苗的研制提供理論依據(jù)。本研究中的分離株DHAV-3-SDWF屬于基因亞型Ⅰa分支，這與系統(tǒng)發(fā)育進化樹的分析結(jié)果一致。

圖3 DHAV-3系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3 Phylogenetic evolutionary tree of DHAV-3

不同年代、不同國家和地區(qū)分離的DHAV-3 VP1核苷酸同源性為90.1%～100%，同源性高。尤其是DHAV-3-SDWF分離株與基因亞型Ⅰa分支中DHAV-3核苷酸同源性更高，均在97.8%以上。

2.4 動物試驗剖檢和組織病理學檢查 通過有限稀釋法測得病毒DHAV-3-SDWF的雞胚半數(shù)致死量為104.5ELD50/ 0.2 mL。試驗攻毒組雛鴨肉眼病變主要表現(xiàn)為肝臟腫脹、色黃，表面斑點狀出血明顯；脾臟腫脹、出血，有灰白色壞死斑點，紅白斑駁；腎臟腫脹、出血（圖4）等。其他器官剖檢變化不明顯。

圖4 攻毒組鴨的剖檢變化Fig.4 Dissection changes of ducks in the challenge group

組織病理學觀察結(jié)果顯示：雛鴨感染DHAV-3后，肝細胞崩解壞死、減少、水泡變性，淋巴細胞浸潤明顯；脾淋巴細胞崩解、壞死；腎小管管腔變窄，上皮細胞脫落，間質(zhì)充血、淋巴細胞浸潤（圖5）。

圖5 攻毒組鴨組織病理變化Fig.5 Histological changes of ducks in challenge group

2.5 不同組織病毒載量的檢測 采用SYBR GreenⅠ實時熒光PCR法檢測攻毒后雛鴨不同組織的病毒載量，結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出，雛鴨攻毒后3 d，其心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、小腸、法氏囊、胰臟等組織均可檢測到DHAV-3的載量，尤其是肝臟中病毒轉(zhuǎn)錄水平最高，與其他組織病毒的轉(zhuǎn)錄水平相比差異顯著（P＜0.05）；脾臟、腎臟、心臟的DHAV-3載量也較高，高于肺臟、小腸、法氏囊，但低于肝臟；肺臟、小腸、法氏囊胰等的DHAV-3載量，雖然與對照組差異顯著（P＜0.05），但病毒載量較低；腦中未檢測到DHAV-3。對照組沒有檢測到病毒的轉(zhuǎn)錄。

圖6 各組織的病毒載量Fig.6 The virus loads of different tissues

3 討論

我國水禽養(yǎng)殖發(fā)展迅速，疫病的發(fā)生對養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展危害嚴重，鴨病毒性肝炎一直是危害我國雛鴨養(yǎng)殖的重要傳染病之一。由于該病血清型多，不同血清型之間幾乎不存在抗原交叉性[12-13]，因此鴨群常出現(xiàn)免疫失敗，對鴨病毒性肝炎優(yōu)勢血清型病原的分離、鑒定及致病性分析可為進一步制定全面有效的防控措施奠定基礎。

隨著我國養(yǎng)鴨業(yè)的迅猛發(fā)展，鴨病毒性肝炎在鴨群中也呈現(xiàn)新的流行趨勢。本研究從山東濰坊某發(fā)病鴨場分離并鑒定1株DHAV-3，該病毒能在鴨胚和雞胚中增殖，在胚體中盲傳幾代，胚體死亡時間穩(wěn)定在3～5 d，這與DHAV-1的傳代特點是一致的。

對分離的病毒進行VP1基因測序，采用MEGA5軟件與GenBank中發(fā)布的25株分離自不同年代、不同國家和地區(qū)的DHAV-3 VP1基因序列進行核苷酸分析。結(jié)果顯示，2007-2020年分離的DHAV-3主要進化形成了2個分支，1分支又進化出2個小分支Ⅰa和Ⅰb。我國不同年代、不同地區(qū)出現(xiàn)的DHAV-3主要分布在分支Ⅰ上，核苷酸同源性高。Ⅰa分支上主要集中分布2012年以后DHAV-3分離株，Ⅰb分支上主要集中分布2012年以前分離的DHAV-3，而分支Ⅱ上主要是越南的2株2012年以前的分離株?？梢?，Ⅰ分支是DHAV-3的主要進化方向，而分支Ⅱ有可能會隨著病毒的變異逐漸消失。DHAV-3的進化有一定的時間親緣性，與分離地區(qū)的關(guān)系不大。這與已經(jīng)報道的DHAV-3的進化與分離年份關(guān)系密切是一致的[3]。

用分離鑒定的DHAV-3對雛鴨進行攻毒試驗，雛鴨感染3 d，剖檢病變主要表現(xiàn)為肝臟、脾臟、腎臟腫大、出血，尤其肝臟病變最嚴重，其他組織器官病變不明顯，這與組織病理學病變的嚴重程度是一致的。而且，肝臟中病毒RNA轉(zhuǎn)錄水平最高，其次是脾臟和腎臟，其他組織病毒RNA轉(zhuǎn)錄水平較低，這些數(shù)據(jù)表明，雛鴨的肝臟是DHAV-3的主要靶器官，其次是脾臟和腎臟[14-15]。

隨著養(yǎng)鴨業(yè)的快速發(fā)展，新病不斷出現(xiàn)，老病仍在流行，鴨病的發(fā)生變得復雜。DHAV-3對雛鴨危害嚴重，一旦感染，發(fā)病率、死亡率極高[16-18]，本研究通過病毒分離、RT-PCR鑒定、動物攻毒試驗等，鑒定病毒為DHAV-3，該病毒與近年來分離的DHAV-3毒株同源性高，對雛鴨的致病性強，這些研究數(shù)據(jù)為今后鴨病毒性肝炎的綜合防治提供理論參考。