于海龍，許榜豐，石曉娜，馬天馨，閆婉婉，李雪松，楊健美，滕巧泱，劉芹防，苑純秀，趙權(quán)，李澤君

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130118；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

H9N2亞型禽流感是由流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起的一種急性、高度接觸性傳染病，不僅給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，而且還可能突破物種屏障直接感染人，危及人類健康[1-2]。目前，雞胚擴增流感病毒生產(chǎn)疫苗是防控H9N2亞型禽流感病毒的最有效方式[3]，但用后的雞胚殘體處理需要額外的人力物力，處理不當還會污染環(huán)境。而且在短時間內(nèi)需要大量病毒時，如在流感病毒大規(guī)模暴發(fā)期間，雞胚擴增病毒無法滿足快速生產(chǎn)需要。因此構(gòu)建適宜流感病毒大量擴增的細胞系是當前流感疫苗研發(fā)需要加快解決的問題。

血凝素蛋白（Hemagglutinin，HA）是流感病毒的主要免疫蛋白，HA蛋白裂解為HA1和HA2是病毒入侵宿主細胞的前提[4]。低致病性禽流感病毒的HA裂解位點處只含有一個堿性氨基酸，只能被呼吸道和腸道所分泌的胰蛋白酶識別并裂解[5]。在細胞中培養(yǎng)時需使用TPCK胰酶和無血清培養(yǎng)液，生產(chǎn)成本高。高致病性禽流感病毒HA裂解位點處含有多個堿性氨基酸，能被宿主細胞內(nèi)普遍存在的蛋白酶識別并裂解，在細胞中培養(yǎng)時無需額外添加輔助試劑。本研究構(gòu)建了穩(wěn)定表達突變?yōu)閺姸玖呀馕稽c的H9 HA蛋白的MDCK細胞系，提供能有效支持H9N2流感病毒擴增的系統(tǒng)，為高效低成本生產(chǎn)流感疫苗提供保障。為了避免HA2蛋白的持續(xù)裂解導(dǎo)致細胞間相互吸附而影響細胞增殖，本研究將HA基因插入四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)中Tet-on系統(tǒng)調(diào)控元件與反應(yīng)元件的中間，在細胞增殖達到要求時再添加強力霉素（doxycycline hydrochloride，DOX）誘導(dǎo)HA基因的表達[6]。

1 材料和方法

1.1 病毒、質(zhì)粒、細胞 H9N2亞型禽流感病毒 A/Chicken/Shanghai/441/2009（簡稱為441株）、PR8 SH441病毒是由本實驗室通過反向遺傳技術(shù)拯救所得，以A/PR/8/34（H1N1）為背景，將HA和NA基因替換成SH441病毒的HA和NA基因的重組病毒、293T細胞及MDCK細胞、質(zhì)粒V2-H9（以lentiCRISPRV2為載體，H9 HA裂解位點上游的1個堿性氨基酸突變?yōu)?個堿性氨基酸后插入到四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)中Tet-on系統(tǒng)的反應(yīng)元件與調(diào)控元件之間，由此構(gòu)建了重組質(zhì)粒V2-H9）、質(zhì)粒psPAX2、質(zhì)粒pMDSV均由上海獸醫(yī)研究所動物流感及禽新發(fā)病毒病病原生態(tài)學(xué)創(chuàng)新團隊保存。

1.2 主要實驗試劑 質(zhì)粒提取試劑盒購自 QIAGEN 公司；DMEM 培養(yǎng)基購自 Hyclone 公司；胎牛血清（FBS）購自 Biosun 公司；無血清培養(yǎng)液opti-MEM購自 Gibco公司；HRP標記的羊抗鼠IgG和FITC標記山羊抗鼠IgG購自Thermo Fisher 公司；鼠抗H9單克隆抗體4B7由本實驗室制備儲存，轉(zhuǎn)染試劑由實驗室制備；Doxycycline、牛血清蛋白（BSA）、細胞搖瓶、MDCK懸浮培養(yǎng)液購自上海源葉生物科技有限公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、SDSPAGE凝膠配制試劑盒購自 Beyotime 公司。

1.3 逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的制備 在T75細胞培養(yǎng)瓶中均勻鋪293T細 胞，待細胞長至80%時用于轉(zhuǎn)染，將V2-H9與提供幾個相關(guān)蛋白來完成擬病毒粒子功能的輔助質(zhì)粒psPAX2、pMDSV分別按照10 μg、5 μg、5 μg的量加入250 μL無血清opti-MEM培養(yǎng)液后，加入轉(zhuǎn)染試劑20 μL，混勻，室溫靜置30 min，在此期間，用無菌PBS緩沖液洗滌293T細胞兩次后每瓶加入5 mL opti-MEM無血清培養(yǎng)液，最后將質(zhì)?；旌衔镏糜诩毎囵B(yǎng)瓶中，再轉(zhuǎn)入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，4 h后換成2% FBS DMEM培養(yǎng)液，72 h后收集含有逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的細胞上清液。

1.4 表達HA蛋白MDCK單克隆細胞的篩選 用收集的逆轉(zhuǎn)錄病毒上清液感染MDCK細胞，24 h后消化MDCK細胞，形成單細胞懸液后，均分在 20 個含5 μg/mL嘌呤霉素和10%FBS的DMEM培養(yǎng)液的細胞培養(yǎng)皿（10×20 mm）中篩選陽性細胞，每隔72 h更換一次含有嘌呤霉素和10%FBS的DMEM培養(yǎng)液。當單個細胞長成細胞群落時，將無菌玻璃管罩在細胞集落上，使玻璃管與平皿完全密封，用PBS洗3遍后，加入200 μL胰酶消化細胞，消化后將細胞移至48孔板擴大培養(yǎng)。

1.5 病毒HA效價的測定 將篩選出的MDCK細胞鋪至細胞瓶中，每株MDCK細胞均勻鋪3瓶T25細胞瓶，并加入DOX進行誘導(dǎo)，同時設(shè)立正常MDCK細胞作對照，待細胞長滿細胞瓶，拿出1瓶細胞消化記數(shù)，剩余兩瓶用作后續(xù)實驗，PR8 SH441病毒按照0.1個MOI的感染劑量接種至T25細胞瓶中，在細胞培養(yǎng)箱中感作2 h，每隔20 min左右取出細胞瓶緩慢搖晃2次，2 h后用無菌PBS清洗細胞瓶底部，洗去未結(jié)合細胞的病毒，然后加入2%FBS培養(yǎng)液維持細胞生長，48 h后收取細胞上清液測血凝價。血凝板中每一行測一個毒的效價，血凝板中先加入50 μL的無菌PBS，然后在每行第一個孔中加入50 μL收集的上清液，用50 μL排槍倍比稀釋至第12個孔，然后在每孔中加入50 μL 1%的雞紅細胞，室溫靜置30 min后讀數(shù)。

1.6 病毒在MDCK細胞系上的生長曲線 將HA效價最高的兩株MDCK細胞鋪至T25細胞瓶中，加入DOX誘導(dǎo)，同時設(shè)立正常MDCK細胞作對照，將病毒按照0.1個MOI的感染劑量接種至T25細胞瓶中，在細胞培養(yǎng)箱中感作2 h，每隔20 min左右取出細胞瓶緩慢搖晃2次，2 h后用無菌PBS清洗細胞瓶底部，洗去未結(jié)合細胞的病毒，加入2%FBS的DMEM培養(yǎng)基維持細胞生長，分別在接種后12、24、48、72 h收取細胞上清液各兩管，每管100 μL，-80℃儲存?zhèn)溆?。同時補加100 μL的2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，最后按照測定TCID50的方法測定上清液中各個時間點的病毒滴度（TCID50/mL），并繪制病毒在篩選到的MDCK細胞上的生長曲線。

1.7 間接免疫熒光（Indirect fluorescence assay，IFA）鑒定 將第34株MDCK單克隆細胞鋪至48孔板，實驗組加入DOX誘導(dǎo)HA蛋白的表達，同時設(shè)立不加DOX誘導(dǎo)為對照組，24 h后棄掉培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min后，加入0.5%Triton通透15 min，然后用1%BSA 37℃封閉30 min后，加入1∶100稀釋的單克隆抗體4B7后置于4℃過夜，37℃下作用90 min，PBS洗3遍后加入1∶200稀釋的FITC標記的羊抗鼠lgG為二抗，37℃作用1 h后，PBS洗4次，放置熒光顯微鏡下觀察。

1.8 Western blot鑒定 將第34株MDCK單克隆細胞鋪至6孔板中，實驗組加入DOX誘導(dǎo)HA蛋白的表達，不加入DOX為對照組，24 h后加入200 μL 1×SDS上樣緩沖液裂解細胞，裂解產(chǎn)物置于95℃金屬浴中變性10 min，配制10孔1.0 mm的10%下層蛋白膠和上層蛋白膠，配置好后每孔加入20 μL的樣品，將電壓調(diào)至60 V跑上層膠，120 V跑下層膠，約1 h后，在250 mA轉(zhuǎn)膜90 min后，用5%脫脂乳室溫封閉50 min，封閉結(jié)束后加入1∶100稀釋的單克隆抗體后置于4B7 4℃過夜，用PBST洗4遍后，以1∶5000 HRP標記的羊抗鼠lgG為二抗，室溫作用45 min后，用PBST洗4遍，用ECL顯色液在顯色儀上曝光并拍照。

1.9 第34株MDCK單克隆細胞低血清馴化以及懸浮培養(yǎng) 將第34株MDCK單克隆細胞采用逐級遞減血清的方法，培養(yǎng)液中的血清濃度逐級遞減，總共分為4個階段，每個階段以血清含量為界，按照血清含量梯度設(shè)計為：10%、8%、5%、2% 4個階段，待MDCK單克隆細胞在每個階段血清濃度中生長穩(wěn)定后方可傳入下一階段，直至該細胞可以在2%FBS培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長。將在2%FBS培養(yǎng)基中生長穩(wěn)定的細胞用胰酶消化后，置于離心機中將細胞離心至離心管底部，然后用無血清培養(yǎng)液吹散細胞，吸取全部的細胞轉(zhuǎn)移至250 mL細胞搖瓶中，補加MDCK無血清培養(yǎng)液至100 mL，然后將細胞搖瓶放入5%CO2、37℃恒溫搖床中懸浮培養(yǎng)，每隔24 h進行半換液（即取出50 mL細胞液，細胞離心后加入50 mL MDCK無血清培養(yǎng)液），以此來保證細胞的營養(yǎng)供給，并記錄細胞密度。

1.10 第34株MDCK懸浮細胞接毒 第34株MDCK懸浮細胞密度為1×106個/mL時加入30 mL DOX誘導(dǎo)HA蛋白的表達，24 h后按照0.1個MOI的感染劑量接毒PR8 SH441，48 h后收取細胞上清液測血凝價，做兩組重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 HA效價的測定 將篩選到的42株MDCK細胞系以0.1個MOI的感染劑量接毒PR8 SH441，每株細胞做一組平行重復(fù)，感染48 h后，收集細胞上清液，然后用1%的雞紅細胞測定病毒的HA效價（圖1）。結(jié)果顯示：對照組MDCK細胞HA效價為3log2，而插入H9 HA的MDCK細胞HA效價達到6log2及以上的有13株，其中第19株和第34株MDCK細胞的HA效價可接近于8 log2。

圖1 PR8 SH441病毒在MDCK細胞系中的復(fù)制滴度Fig.1 Replication of PR8 SH441 virus in MDCK cell lines

2.2 PR8 SH441病毒在MDCK單克隆細胞上的生長曲線 PR8 SH441病毒以0.1個MOI的劑量感染篩選出的第19株和第34株MDCK細胞，并且以正常MDCK作對照，在感染后12、24、48、72 h后收集細胞上清液，并且每株細胞做一組平行重復(fù)，然后應(yīng)用流感病毒TCID50測定病毒滴度，繪制出PR8 SH441病毒在MDCK細胞中的生長曲線（圖2）。結(jié)果顯示：第34株MDCK單克隆細胞更有利于病毒的復(fù)制。

圖2 PR8 SH441病毒在MDCK細胞系上的生長曲線Fig.2 Growth curve of PR8 SH441 virus in MDCK cell lines

2.3 IFA鑒定 結(jié)果顯示：表達H9 HA的第34株MDCK單克隆細胞在細胞膜上顯示特異性熒光，而對照組中無綠色熒光（見圖3），證明H9 HA已經(jīng)成功在MDCK細胞中定位表達并定位在細胞膜上。

圖3 表達HA基因的第34株MDCK單克隆細胞的IFA鑒定結(jié)果Fig.3 IFA analysis of HA gene expression in 34th MDCK monoclonal cell

2.4 Western blot鑒定 表達H9 HA的第34株MDCK單克隆細胞樣品呈現(xiàn)出一條特異性條帶，分子量大小為76 KDa，與HA的分子量相符合，而對照組MDCK細胞樣品中無HA蛋白大小的特異性條帶，GAPDH作為內(nèi)參，分子量大小為36 KDa（圖4）。

圖4 表達HA基因的第34株MDCK單克隆細胞Western blot檢測結(jié)果Fig.4 Western blot analysis of HA gene expression in 34th MDCK monoclonal cell

2.5 第34株MDCK單細胞的懸浮培養(yǎng) 將第34株MDCK單克隆細胞置于5%CO2、37℃恒溫搖床中懸浮培養(yǎng)，每隔24 h記錄細胞密度（圖5）。結(jié)果顯示，第34株MDCK單克隆細胞可以在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)。

圖5 第34株MDCK單克隆細胞的懸浮培養(yǎng)Fig.5 Suspension culture of the 34th MDCK monoclonal cell

2.6 PR8 SH441病毒在第34株MDCK懸浮細胞HA效價的測定 在感染病毒PR8 SH441 48 h后，收集細胞上清液，然后用1%的雞紅細胞測定病毒的HA效價，PR8 SH441病毒在第34株MDCK懸浮細胞HA效價可達到9log2（圖6）。

圖6 PR8 SH441病毒在第34株MDCK懸浮細胞中的復(fù)制滴度Fig.6 The replication titer of PR8 SH441 virus in the 34th MDCK suspension cell

3 討論

疫苗對于流感病毒的防控依舊是目前最直接、最有效的手段[7]。禽流感疫苗的傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝是將禽流感病毒接種 SPF 雞胚，收獲尿囊液獲得。但是雞胚衍生疫苗的生產(chǎn)無法滿足大規(guī)模需求，同時雞胚用后的處理也會給環(huán)境造成壓力，因此，促使人們將目光聚焦在以細胞基質(zhì)生產(chǎn)流感疫苗的方式上，而MDCK細胞是公認的制備流感疫苗最有前景的細胞[8-9]。

慢病毒載體在細胞和基因治療中應(yīng)用十分廣泛，是一種十分強大的遺傳工具。受感染細胞產(chǎn)生的后代將攜帶相同的轉(zhuǎn)基因，高滴度的慢病毒顆粒需要合適的細胞來生產(chǎn)。通常，選擇的細胞是人胚胎腎細胞293（HEK-293），特別是衍生的293T細胞。293T細胞不僅增殖速度快，轉(zhuǎn)染效率高，而且它還被證實能提高慢病毒的滴度。由于慢病毒感染的方式是將外源基因隨機插入到細胞基因組中，由于插入位置的不確定性，所以病毒在每株MDCK細胞上形成的HA效價存在差異。本研究通過慢病毒感染的方式將H9 HA插入MDCK細胞中，通過血凝試驗和病毒生長曲線發(fā)現(xiàn)：在篩選到的42株MDCK細胞系中，第34株MDCK單克隆細胞株最有利于流感病毒的復(fù)制。

繼續(xù)將第34株MDCK單克隆細胞進行懸浮培養(yǎng)以用于后續(xù)疫苗的生產(chǎn)。近年來，應(yīng)用全懸浮細胞培養(yǎng)技術(shù)增殖培養(yǎng)病毒已廣泛應(yīng)用于生物制藥行業(yè)。與傳統(tǒng)貼壁培養(yǎng)技術(shù)相比，應(yīng)用細胞系懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)工藝有著巨大的優(yōu)勢。一方面，可大大增加單位體積的細胞密度，提高病毒滴度；另一方面，培養(yǎng)條件安全可控，全封閉、管道化系統(tǒng)生產(chǎn)不僅降低了污染幾率，而且減輕了勞動強度，提高了生產(chǎn)效率；第三方面，技術(shù)成熟，產(chǎn)量和質(zhì)量均可顯著提高。

綜上所述，本研究篩選出42株可控表達H9 HA蛋白的MDCK細胞系，通過血凝試驗和生長曲線發(fā)現(xiàn)第34株MDCK單克隆細胞最適合流感病毒的復(fù)制，并將該細胞株馴化后懸浮培養(yǎng)，可為細胞基質(zhì)生產(chǎn)流感疫苗提供高效的細胞系。