姜維雨，丁 鏟，廖 瑛

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

新城疫是危害養(yǎng)禽業(yè)的一類動(dòng)物疫病，由感染新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起，以高熱、呼吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血為癥狀，具有很高的發(fā)病率和死亡率。NDV基因組RNA長(zhǎng)度為15 186 bp，依次編碼6個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）、磷蛋白（phosphate protein，P）、基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）、血凝素神經(jīng)氨酸酶蛋白（hemagglutinin-neuraminidase protein，HN）和大分子蛋白（large protein，L）。P基因還通過(guò)RNA編碼兩個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白：V和W。NP的氨基端包裹病毒基因組RNA，以避免其被降解[1]；其羧基端則發(fā)揮RNA聚合酶的作用[2]。M蛋白為疏水蛋白，沒(méi)有跨膜區(qū)，位于囊膜與核衣殼之間。在病毒復(fù)制早期，M蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)；在病毒復(fù)制晚期，M蛋白出核到達(dá)細(xì)胞膜，與F蛋白和HN蛋白相互作用，并與核衣殼結(jié)合，最終完成病毒粒子組裝和出芽。另有研究表明，M蛋白負(fù)責(zé)維持病毒核衣殼的球形形狀[3]。

核不均一核糖體蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，hnRNP）有A和B兩個(gè)亞家族，主要分布在細(xì)胞核內(nèi)，與細(xì)胞核中的前體mRNA相互作用，影響前體mRNA的加工以及mRNA的代謝和轉(zhuǎn)運(yùn)[4]。該家族的典型成員hnRNPA1廣泛參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和mRNA的加工[5]，并跟神經(jīng)退行性疾病相關(guān)[6]。hnRNPA1通過(guò)以下方式發(fā)揮功能：（1）轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)：在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，hnRNPA1結(jié)合到雙鏈DNA上的特定靶序列，形成蛋白-蛋白復(fù)合物，抑制轉(zhuǎn)錄[7]；（2）mRNA拼接控制：真核生物的蛋白質(zhì)組多樣性在很大程度上取決于前體mRNA選擇性拼接的程度，而hnRNPA1能影響剪接體對(duì)前體mRNA選擇性剪接位點(diǎn)的選擇；（3）應(yīng)激顆粒的組裝：應(yīng)激顆粒是細(xì)胞壓力應(yīng)激時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中形成的蛋白和RNA聚集顆粒[8]。hnRNPA1因其RNA結(jié)合特性以及與蛋白質(zhì)相互作用而參與應(yīng)激顆粒的組裝[9]；（4）MicroRNA的加工；（5）端粒延長(zhǎng)。

已有研究結(jié)果表明，hnRNPA1促進(jìn)非典型肺炎冠狀病毒[10]、鼠肝炎病毒[11]、豬流行性腹瀉病毒[12]、腸道病毒[13]，以及辛德畢斯病毒[14]的復(fù)制。然而，hnRNPA1對(duì)副粘病毒復(fù)制的影響尚未有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，NDV感染可促進(jìn)hnRNPA1從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并與NDV核衣殼蛋白NP發(fā)生共定位和相互作用?？紤]到hnRNPA1和NP均有RNA結(jié)合能力，我們推測(cè)hnRNP A1通過(guò)NP蛋白結(jié)合到病毒RNA基因組，參與了病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Flag-HRP抗體及HA-HRP抗體購(gòu)自MBL公司；anti-hnRNPA1抗體購(gòu)自CST公司；RIPA購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；TRIzol裂解液購(gòu)自Thermo Fisher公司；反轉(zhuǎn)錄酶MLV購(gòu)自Promega公司；Anti-Flag抗體親和凝膠購(gòu)自Bimake公司。

1.2 細(xì)胞與病毒 HeLa細(xì)胞及293T細(xì)胞購(gòu)自ATCC，并由本實(shí)驗(yàn)室保存。培養(yǎng)于含10% FBS（Gibco）、雙抗（細(xì)胞培養(yǎng)用青霉素-鏈霉素）的DMEM，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株Herts/33由中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供，本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 NDV感染 以5×105個(gè)HeLa細(xì)胞鋪6孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%時(shí)用PBS洗細(xì)胞3次，無(wú)血清DMEM稀釋NDV，以1 MOI（multiplicity of infection）感染細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱吸附1 h。PBS清洗細(xì)胞3次，去除未吸附的病毒后，更換為2% FBS DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 間接免疫熒光（indirect immunofluorescence assay，IFA） 以4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15 min；0.5% TritonX-100室溫透化細(xì)胞15 min；以3% BSA 37℃條件下封閉1 h；37℃孵育anti-NDV NP鼠源單克隆抗體2 h，37℃孵育Alexa Fluor 488 nm goat anti-Mouse IgG熒光二抗1 h；37℃孵育anti-hnRNPA1兔源抗體2 h；37℃孵育Alexa Fluor 594 nm goat anti-Rabbit IgG熒光二抗1 h；室溫孵育DAPI染色液10 min。在載玻片中央滴一滴抗熒光猝滅封片劑，取出細(xì)胞爬片倒扣于封片劑上，室溫避光風(fēng)干，使用蔡司激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 以每孔5×105個(gè)HeLa細(xì)胞鋪板。待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～80%時(shí)，使用Fugene HD轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

1.6 免疫共沉淀 以8×107個(gè)293T細(xì)胞鋪100 mm培養(yǎng)皿。12 h后，分別轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Flag-M和HA-hnRNPA1、Flag-NP和HA-hnRNPA1、Flag-P和HA-hnRNPA1、pCMV-Flag載體和HA-hnRNPA1各3 μg。轉(zhuǎn)染24 h后以RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心取上清液，加入Anti-Flag親和凝膠中，4℃旋轉(zhuǎn)孵育4 h。以2400 ×g離心10 s，棄上清液。利用RIPA裂解液洗3～5次，徹底棄去上清液，加入50 μL 2×SDS上樣緩沖液，100℃金屬浴10 min。樣品用于后續(xù)SDS-PAGE和Western blot分析。

1.7 siRNA設(shè)計(jì)及siRNA干擾 根據(jù)hnRNPA1（GenBank登錄號(hào)：XM_005268826）基因序列，設(shè)計(jì)siRNA（序列為5'-AGCAAGAGATG GCTAGTGC-3'），由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，同時(shí)合成一段無(wú)義對(duì)照siNC（序列為5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'）。

待細(xì)胞長(zhǎng)至40%時(shí)，用Lipofectamine 2000進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。36 h后，以1 MOI的NDV感染。感染后12 h收取細(xì)胞樣品，Western blot檢測(cè)干擾效果和病毒蛋白的表達(dá)，或熒光定量RT-PCR檢測(cè)病毒的RNA水平。

1.8 SDS-PAGE及Western blot鑒定 將蛋白樣品室溫離心10 min后取10 μL上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，并轉(zhuǎn)印至NC膜上。5%脫脂乳室溫封閉NC膜1 h后，4℃孵育一抗過(guò)夜，PBST洗3次，再室溫孵育NC膜和HRP標(biāo)記的二抗1 h，PBST洗3次。然后將NC膜置于發(fā)光液中孵育2 min，在化學(xué)圖像分析儀中顯影并保存圖像。

1.9 細(xì)胞RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量PCR 6孔板每孔加1 mL TRIzol細(xì)胞裂解液抽提RNA，將細(xì)胞裂解液移入無(wú)RNA酶離心管中，加入200 mL氯仿，劇烈震蕩15 s。靜置5 min后，13 700 ×g、4℃離心15 min，小心吸取上清液至新的無(wú)RNA酶離心管。加入200 mL異丙醇，-20℃沉淀2 h。13 700 ×g、4℃離心15 min，棄上清液，加入75%乙醇，13 700 ×g、4℃離心10 min。徹底棄去上清液，室溫風(fēng)干至乙醇完全揮發(fā)。加入30 μL DEPC水，65℃孵育15 min溶解RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)量RNA濃度。

取3 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以cDNA為模板，采用SYBR Green染料法進(jìn)行熒光定量RT-PCR，引物如表1所示。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)含量，以β-actin做為內(nèi)參基因。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Primers of RT-qPCR

2 結(jié)果

2.1 NDV感染導(dǎo)致hnRNPA1出核 以1 MOI NDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株Herts/33感染HeLa細(xì)胞，Mock感染為對(duì)照組。利用NDV NP鼠源抗體及hnRNPA1兔源抗體進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)病毒蛋白NP和hnRNPA1的亞細(xì)胞定位。結(jié)果可知，在Mock感染的細(xì)胞中，hnRNPA1聚集于細(xì)胞核；NDV感染16 h，少量的hnRNPA1蛋白出核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并與病毒核衣殼蛋白NP共定位（圖1）。以上結(jié)果表明，NDV感染促進(jìn)hnRNPA1出核，遷移至病毒核衣殼蛋白NP所在位置。

圖1 NDV病毒感染誘導(dǎo)hnRNPA1蛋白出核，與病毒蛋白NP共定位Fig.1 NDV infection induced hnRNPA1 nuclear export and co-localized with viral protein NP

2.2 NDV NP和M蛋白與hnRNPA1存在相互作用 在非典型冠狀病毒、鼠肝炎病毒及豬流行性腹瀉病毒感染過(guò)程中，感染引起hnRNPA1出核，并與病毒核衣殼蛋白NP相互作用，影響病毒基因組RNA的復(fù)制。通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，hnRNPA1出核后，與NDV核衣殼蛋白NP共定位。NP結(jié)合病毒負(fù)鏈基因組RNA，并與P蛋白、L蛋白一起，形成病毒復(fù)制小體[15]。因此，我們推測(cè)hnRNPA1出核后，遷移至病毒復(fù)制小體，參與病毒的復(fù)制。為了證實(shí)以上推測(cè)，我們?cè)?93T細(xì)胞中共表達(dá)Flag-NP和HA-hnRNPA1、Flag-P和HA-hnRNPA1、Flag-M蛋白和HA-hnRNPA1，或者pCMV-Flag載體和HA-hnRNPA1。24 h后裂解細(xì)胞，以Anti-Flag親和凝膠進(jìn)行免疫共沉淀，再利用HA抗體進(jìn)行Western blot，檢測(cè)HA-hnRNPA1是否跟Flag標(biāo)簽的病毒蛋白共沉淀。結(jié)果可知，在全細(xì)胞裂解液中，各個(gè)帶Flag標(biāo)簽的病毒蛋白和帶HA標(biāo)簽的hnRNPA1均成功表達(dá)；在免疫共沉淀的樣品中，HA-hnRNPA1被Flag-NP和Flag-M共沉淀，但不能被Flag-P或者pCMV-Flag載體共沉淀，揭示hnRNPA1跟NP和M蛋白相互作用，跟P蛋白不存在相互作用（圖2）。

圖2 NDV NP和M蛋白與hnRNPA1相互作用Fig.2 NDV NP and M interact with hnRNPA1

2.3 干擾hnRNPA1的表達(dá)不利于NDV的復(fù)制 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明：NDV感染導(dǎo)致hnRNPA1出核，且hnRNPA1遷移至病毒復(fù)制小體，與病毒的NP、M蛋白相互作用。但hnRNPA1在病毒的感染過(guò)程中，發(fā)揮了促進(jìn)病毒增殖的作用還是抗病毒作用呢？我們?cè)贖eLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染sihnRNPA1干擾hnRNPA1的表達(dá)，以轉(zhuǎn)染non-target control siRNA（NC）作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染siRNA 36 h之后，以1 MOI劑量的NDV感染細(xì)胞，12 h后收取細(xì)胞樣品，以Western blot檢測(cè)hnRNPA1的干擾效果和病毒蛋白的表達(dá)。結(jié)果可知，與NC對(duì)照組相比較，sihnRNPA1成功地干擾了hnRNPA1的表達(dá)，并且，病毒蛋白NP的表達(dá)略有降低（圖3A）。進(jìn)一步檢測(cè)NDV NP mRNA發(fā)現(xiàn)，相較于NC組，干擾hnRNPA1的實(shí)驗(yàn)組NDV的mRNA水平顯著降低（圖3B）。以上結(jié)果揭示hnRNPA1對(duì)病毒復(fù)制起著促進(jìn)作用。

圖3 siRNA干擾hnRNPA1的表達(dá)不利于NDV的復(fù)制Fig.3 siRNA knock down of hnRNPA1 does not support NDV replication

2.4 外源表達(dá)hnRNPA1有利于NDV復(fù)制 在HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染HA-hnRNPA1質(zhì)粒時(shí)，以另一組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-HA載體作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后，以1 MOI NDV感染，12 h收取細(xì)胞樣品，Western blot檢測(cè)HA-hnRNPA1和病毒蛋白的表達(dá)。結(jié)果可知，HA-hnRNPA1成功表達(dá)；與pCMV-HA轉(zhuǎn)染組相比較，HA-hnRNPA1顯著促進(jìn)了病毒蛋白NP的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)病毒mRNA發(fā)現(xiàn)，相較于pCMV-HA對(duì)照組，HA-hnRNPA1促進(jìn)病毒mRNA的復(fù)制水平（圖4B）。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了hnRNPA1對(duì)NDV復(fù)制增殖的促進(jìn)作用。

圖4 外源表達(dá)hnRNPA1促進(jìn)NDV復(fù)制Fig.4 Overexpression of hnRNPA1 enhances NDV replication

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NDV感染導(dǎo)致hnRNPA1出核，與病毒核衣殼蛋白NP共定位，并能結(jié)合NP，說(shuō)明hnRNPA1可能遷移到病毒復(fù)制小體，參與病毒的復(fù)制。出乎意料的是，病毒M蛋白也與hnRNPA1有相互作用。有報(bào)道表明，NDV M蛋白在感染早期進(jìn)入細(xì)胞核，抑制宿主細(xì)胞RNA轉(zhuǎn)錄，有助于病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[16]。我們推測(cè)M蛋白進(jìn)入細(xì)胞核后，促進(jìn)hnRNPA1出核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，遷移至病毒復(fù)制小體，促進(jìn)病毒基因組RNA的合成及mRNA的轉(zhuǎn)錄。然而，hnRNPA1的出核機(jī)制尚不清楚，還需要進(jìn)一步研究。

進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，siRNA干擾hnRNPA1的表達(dá)，病毒RNA復(fù)制和蛋白表達(dá)有所下降，外源表達(dá)hnRNPA1，病毒RNA復(fù)制和蛋白表達(dá)均有所升高，說(shuō)明hnRNPA1確實(shí)有助于病毒的復(fù)制增殖。雖然干擾或過(guò)表達(dá)hnRNPA1對(duì)病毒的復(fù)制有影響，但幅度不大。造成這一結(jié)果的原因，可能是由于轉(zhuǎn)染效率的緣故：不是所有的細(xì)胞都能有效地轉(zhuǎn)染hnRNPA1質(zhì)粒或者siRNA，這一部分未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，干擾了實(shí)驗(yàn)結(jié)果；另一個(gè)可能性是hnRNPA1對(duì)病毒復(fù)制起到輔助作用，但不是必需的。

以往關(guān)于hnRNPA1參與病毒復(fù)制的研究，多集中在冠狀病毒、禽流感、甲病毒及腸道病毒[13]。在腸道病毒感染過(guò)程中，hnRNPA1通過(guò)改變病毒IRES（internal ribosome entry sites，IRES）的結(jié)構(gòu)以促進(jìn)病毒復(fù)制；在辛德畢斯病毒感染過(guò)程中，hnRNPA1通過(guò)促進(jìn)病毒正鏈RNA和負(fù)鏈RNA的合成，幫助病毒復(fù)制；在冠狀病毒科的非典型肺炎冠狀病毒、鼠肝炎病毒及豬流行性腹瀉病毒感染過(guò)程中，hnRNPA1與核衣殼蛋白N相互作用，促進(jìn)病毒基因組復(fù)制。以上研究說(shuō)明，hnRNPA1對(duì)不同病毒復(fù)制的影響機(jī)制有所區(qū)別。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)hnRNPA1與NDV核衣殼蛋白NP相互作用，促進(jìn)病毒復(fù)制增殖，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究首次證實(shí)了hnRNPA1參與副粘病毒的復(fù)制。鑒于hnRNPA1結(jié)合RNA的特性，推測(cè)此蛋白家族可能廣泛性地參與RNA病毒的復(fù)制。