蔡雨豪，王 蒙，王春艷，丁田耘，張浩然，袁聰俐

（上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240）

巴爾通體（Bartonlla）是一種胞內(nèi)寄生、兼性厭氧的革蘭氏陰性菌[1]。漢賽巴爾通體（Bartonella henselae，Bhe）以貓為天然宿主，除了以節(jié)肢動(dòng)物為媒介進(jìn)行傳播外，還可通過(guò)攜帶該病原的貓抓傷或者咬傷感染人，是已知的巴爾通體中致病譜最廣的病原體[2-3]。具有正常免疫功能的人感染漢賽巴爾通體后主要表現(xiàn)為自限性淋巴結(jié)腫大，伴有發(fā)熱等癥狀，還可能引發(fā)慢性菌血癥、感染性心內(nèi)膜炎、骨髓炎等疾病[4-5]。而有免疫缺陷的患者，感染漢賽巴爾通體會(huì)導(dǎo)致桿菌樣血管瘤，一般表現(xiàn)為皮膚表面長(zhǎng)出數(shù)個(gè)至數(shù)十個(gè)分散的丘疹或結(jié)節(jié)[6]。這是由漢賽巴爾通體感染后在皮膚上產(chǎn)生的血管增生性損傷引起的[6-7]。另外，免疫缺陷的患者還可能發(fā)生桿菌樣紫癜，通常表現(xiàn)為腹痛、嘔吐厭食，伴隨發(fā)熱等癥狀[7-8]。

研究表明，巴爾通體Ⅳ型分泌系統(tǒng)分泌的效應(yīng)蛋白（Bartonellaeffector proteins，Beps）是典型的多結(jié)構(gòu)域蛋白，主要由有酶活性的cAMP炎癥誘導(dǎo)區(qū)域（filamentation induced by cAMP，F(xiàn)IC）和參與分泌的巴爾通體胞內(nèi)呈遞區(qū)域（bep intracellular delivery，BID）結(jié)構(gòu)域組成[9-10]。已有研究發(fā)現(xiàn)，效應(yīng)蛋白BepE在漢賽巴爾通體的體內(nèi)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移及導(dǎo)致桿菌樣血管瘤的過(guò)程中行使重要功能，其BID結(jié)構(gòu)域可以挾持樹(shù)突狀細(xì)胞作為運(yùn)輸工具，促使巴爾通體菌定殖于血液系統(tǒng)[11-12]。通過(guò)細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)BepE具有促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞遷移的功能，同時(shí)BepE可以抑制由BepC等其他效應(yīng)蛋白導(dǎo)致的細(xì)胞碎片化現(xiàn)象（cell fragmentation）[13-14]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是漢賽巴爾通體感染的主要靶細(xì)胞之一[15]，BepE在漢賽巴爾通體感染血管內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中是否也具有促進(jìn)細(xì)胞遷移的功能尚未報(bào)道。

本研究采用同源重組基因敲除技術(shù)構(gòu)建BepE基因敲除及回補(bǔ)菌株，通過(guò)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究BepE對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響，為后續(xù)研究BepE在漢賽巴爾通體感染HUVEC過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與細(xì)胞 漢賽巴爾通體ATCC 49882（ATCC，美國(guó)）、pJM05質(zhì)粒與pANT4質(zhì)粒由加利福尼亞大學(xué)舊金山分?；葙?zèng)；HUVEC人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購(gòu)自澳賽爾斯生物技術(shù)有限公司；DH5α與S17-1感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海唯地生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂購(gòu)自O(shè)XOID公司；無(wú)菌脫纖維綿羊全血購(gòu)自杭州新銳生物工程有限公司；Medium 199/EBSS培養(yǎng)基、內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司；Fast pfu fly DNA Polymerase高保真酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SalⅠ、BamHⅠ、PstⅠ等限制性核酸內(nèi)切酶與T4 DNA連接酶購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；2×Hieff?Robust PCR Master Mix (With Dye)、Hieff Clone?Plus Multi One Step Cloning Kit購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；SurePAGE?蛋白預(yù)制膠、20×MOPS電泳緩沖液購(gòu)自金斯瑞生物科技有限公司；卡那霉素、萘啶酸、頭孢唑啉等抗生素購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

1.3 漢賽巴爾通體BepE基因的敲除

1.3.1 BepE敲除質(zhì)粒pJM05-ΔBepE的構(gòu)建 根據(jù)Bartonellahenselaestrain Houston-1（GenBank登錄號(hào)：BX897699.1）及質(zhì)粒pJM05的序列設(shè)計(jì)P1-F/P1-R、P2-F/P2-R兩對(duì)引物，擴(kuò)增漢賽巴爾通體BepE上、下游同源片段P1與P2（612 bp、579 bp），再設(shè)計(jì)缺失片段外引物BheⅠ-F/BheⅠ-R及缺失片段內(nèi)引物BheⅡ-F/BheⅡ-R鑒定BepE缺失突變型Bhe-ΔBepE（2613 bp、1100 bp）。引物序列如表1所示。

表1 本研究中所用引物Table 1 Primers used in this study

以漢賽巴爾通體ATCC 49882株為模板，用高保真酶擴(kuò)增同源片段P1與P2，PCR擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行核酸凝膠電泳，對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收。用BamHⅠ、SalⅠ限制性核酸內(nèi)切酶對(duì)PJM05質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并通過(guò)核酸凝膠電泳對(duì)目的條帶進(jìn)行膠回收。用Hieff Clone?Plus Multi One Step Cloning Kit對(duì)同源片段P1、P2與酶切后的pJM05質(zhì)粒進(jìn)行一步法連接。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，并涂布于Kan+抗性平板上，次日挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定并測(cè)序，結(jié)果正確的即為敲除質(zhì)粒pJM05-ΔBepE。

1.3.2 單交換菌株的制備 將敲除質(zhì)粒pJM05-ΔBepE轉(zhuǎn)化S17-1感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于Kan+抗性平板上。次日挑取單菌落搖菌14～16 h。將菌液以1∶100稀釋，復(fù)搖2～3 h，至OD600達(dá)到0.6～0.8。取1 mL復(fù)搖后的S17-pJM05-ΔBepE菌液，6000×g離心3 min，棄上清液，用M199S培養(yǎng)基洗3次，用700 μL的M199S培養(yǎng)基重懸菌體。取重懸后的菌液進(jìn)行1∶1、1∶10、1∶100稀釋，各取500 μL涂布至生長(zhǎng)4 d的三代Bhe平板上，輕轉(zhuǎn)鋪勻平板，正置于35℃培養(yǎng)箱孵育5～6 h。

刮取孵育好的菌體至1 mL的M199S培養(yǎng)基中，混勻后做1∶10、1∶100、1∶1000稀釋，將不同濃度菌液涂布至三抗血平板上（卡那霉素、萘啶酸與頭孢唑林抗性），倒置于35℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

挑取三抗平板上的單菌落劃線至Kan+血平板上，35℃條件下培養(yǎng)4～5 d，得到pJM05-ΔBepE整合到Bhe基因組上的漢賽巴爾通體單交換菌株[15]。

1.3.3 SacB蔗糖篩選及PCR鑒定 將Bhe單交換菌刮到1 mL的M199S培養(yǎng)基中，混勻后做1∶10、1∶100、1∶1000稀釋，分別涂布到10%蔗糖血平板上。SacB基因水解蔗糖產(chǎn)生大量果聚糖，對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒性，通過(guò)蔗糖壓力篩選能使pJM05發(fā)生二次重組從而從基因組中置換下來(lái)，導(dǎo)致Bhe發(fā)生BepE缺失突變，平板上長(zhǎng)出的即為Bhe野生型菌或BepE缺失突變菌。

設(shè)計(jì)缺失片段外引物BheⅠ-F/BheⅠ-R及缺失片段內(nèi)引物BheⅡ-F/BheⅡ-R，用于鑒定SacB蔗糖篩選后的野生型和突變型菌株，引物序列如表1所示。在血平板上刮取少量菌作模板，進(jìn)行PCR鑒定，根據(jù)PCR結(jié)果鑒定出BepE缺失突變型Bhe-ΔBepE。

1.4 Bhe-BepE回補(bǔ)表達(dá)菌的構(gòu)建及表達(dá)鑒定

1.4.1 BepE回補(bǔ)表達(dá)質(zhì)粒pANT4-BepE-Flag的構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成BepE-F/BepE-R引物，擴(kuò)增漢賽巴爾通體BepE與Flag標(biāo)簽的融合片段（該片段由本實(shí)驗(yàn)合成并保存），引物序列如表1所示。

用BamHⅠ/PstⅠ限制性核酸內(nèi)切酶分別對(duì)pANT4質(zhì)粒與BepE-Flag片段進(jìn)行雙酶切，通過(guò)核酸電泳回收質(zhì)粒與片段。使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)，涂布于Kan+抗性LB平板上。次日挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定并測(cè)序，結(jié)果正確的即為回補(bǔ)表達(dá)質(zhì)粒pANT4-BepEFlag。

1.4.2 pANT4-BepE-Flag回補(bǔ)Bhe-ΔBepE 將回補(bǔ)表達(dá)質(zhì)粒pANT4-BepE-Flag轉(zhuǎn)化S17-1感受態(tài)，并與BepE缺失突變型菌進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，方法同1.3.2。

待三抗血平板上長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌落劃線到Kan+血平板上，35℃培養(yǎng)4～5 d，得到BepE的回補(bǔ)表達(dá)菌株Bhe-pBepE。

1.4.3 回補(bǔ)表達(dá)菌株Bhe-pBepE的表達(dá)鑒定 刮取少量Bhe-pBepE菌到1×SDS PAGE蛋白上樣緩沖液中，混勻后100℃水浴加熱12 min，進(jìn)行Western blot鑒定。取10 μL蛋白樣品，140 V電壓下電泳60 min。將PVDF膜用甲醇激活1 min，110 V電壓下轉(zhuǎn)膜60 min。轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1 h。再用抗Flag標(biāo)簽的小鼠單克隆抗體室溫孵育2 h，TBST洗5次，每次5 min。用羊抗鼠IgG(H+L)二抗室溫孵育60 min，TBST清洗5次，每次5 min，加入ECL超敏發(fā)光顯色液進(jìn)行發(fā)光顯色并拍照記錄。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 在24孔板上鋪2×104個(gè)HUVEC細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%時(shí)，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗3遍，加入2.5%FBS的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基。分別用Bhe-ΔBepE、Bhe-pBepE及Bhe野生型感染HUVEC（MOI=500），以只加內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基的細(xì)胞為陰性對(duì)照。

感染24 h后，用無(wú)菌的移液槍槍頭在24孔板上劃一道豎直的劃痕，盡量保持劃痕寬度一致，用倒置顯微鏡及活細(xì)胞工作站定時(shí)、定點(diǎn)拍攝同一位置的劃痕區(qū)域（每組選擇3個(gè)位點(diǎn)）。利用ImageJ軟件處理圖片，分別計(jì)算各個(gè)位點(diǎn)0 h、6 h、12 h與18 h的劃痕區(qū)域面積，以每個(gè)位點(diǎn)減少的劃痕區(qū)域面積與0 h的劃痕面積的比值為該位點(diǎn)的細(xì)胞遷移率，從而用GraphPad Prism8軟件比較各組的細(xì)胞遷移能力。

1.6 Transwell小室實(shí)驗(yàn) 用慢病毒分別包被Bhe-BepE-Flag基因與空白Flag標(biāo)簽（由吉滿生物科技有限公司合成），感染HUVECs。用明膠包被Transwell小室（直徑6.5 mm，PC膜孔徑8.0 μm），取300 μL感染48 h的HUVECs加入小室上層，下層加700 μL細(xì)胞培養(yǎng)基。6 h后擦去上層細(xì)胞，用hoechst染料對(duì)下層細(xì)胞進(jìn)行染色并計(jì)數(shù)，以下層細(xì)胞數(shù)量多少評(píng)價(jià)HUVECs遷移能力。

2 結(jié)果

2.1 敲除質(zhì)粒與回補(bǔ)質(zhì)粒的鑒定 對(duì)重組pJM05-ΔBepE與pANT4-BepE-Flag質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示，在1200 bp與1600 bp左右處有目的條帶，分別與ΔBepE、BepE-Flag基因大小相符。

2.2Bhe-ΔBepE的缺失鑒定與Bhe-pBepE的表達(dá)鑒定通過(guò)SacB蔗糖壓力篩選，pJM05質(zhì)粒從Bhe基因組上掉落，得到回復(fù)野生型和缺失突變型兩種菌株。用缺失片段外引物BheⅠ-F/BheⅠ-R及缺失片段內(nèi)引物BheⅡ-F/BheⅡ-R對(duì)兩種菌進(jìn)行PCR鑒定。BepE框內(nèi)缺失片段大小為1167 bp，所以利用引物BheⅠ-F/BheⅠ-R擴(kuò)增Bhe野生型得到片段大小為2613 bp，而缺失突變型Bhe-ΔBepE的擴(kuò)增片段大小為1446 bp。利用缺失片段內(nèi)引物BheⅡ-F/BheⅡ-R擴(kuò)增野生型Bhe的片段大小為1100 bp，而缺失突變體擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)該為陰性。如圖2A、2B所示，1～8號(hào)為BepE缺失突變株，9號(hào)為陰性對(duì)照，10號(hào)為Bhe野生型對(duì)照。

由于BepE的回補(bǔ)表達(dá)株Bhe-pBepE能夠通過(guò)其OriV復(fù)制起始位點(diǎn)與Ptac強(qiáng)啟動(dòng)子持續(xù)表達(dá)帶Flag標(biāo)簽的BepE蛋白。因此用抗Flag標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot鑒定，在68 kDa處出現(xiàn)清晰可見(jiàn)的條帶，及數(shù)條BepE蛋白降解條帶，而對(duì)照組Bhe-ΔBepE因不含帶Flag標(biāo)簽的BepE而未顯示條帶（如圖2c所示）。該結(jié)果說(shuō)明BepE成功回補(bǔ)表達(dá)。

圖1 重組質(zhì)粒的鑒定Fig.1 PCR identification of recombinant plasmid

圖2 Bhe-ΔBepE與Bhe-pBepE的鑒定Fig.2 Identification of Bhe-ΔBepE and Bhe-pBepE

2.3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 分別用Bhe-ΔBepE、Bhe-pBepE及Bhe野生型感染HUVECs，以只加內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基的細(xì)胞為陰性對(duì)照。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖3所示。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Experiment results of wound healing assay

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HUVEC細(xì)胞從劃痕邊界不斷向中間遷移，通過(guò)（初始劃痕面積-某一時(shí)刻的面積）/初始面積計(jì)算該時(shí)刻細(xì)胞的遷移率。利用GraphPad Prism8軟件對(duì)4組細(xì)胞0、6、12和18 h的遷移率進(jìn)行比較，結(jié)果顯示差異并不顯著（P＞0.05）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，BepE無(wú)法促進(jìn)巴爾通體感染HUVEC的遷移能力。

2.4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果 分別用包被Bhe-BepEFlag基因與空白Flag標(biāo)簽的慢病毒感染HUVECs并進(jìn)行Transwell小室實(shí)驗(yàn)，顯微鏡下各取12個(gè)視野計(jì)算下層細(xì)胞數(shù)量。如圖4所示，兩組中遷移入下室的細(xì)胞數(shù)量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。說(shuō)明在細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)Bhe-BepE也無(wú)法促進(jìn)HUVEC的遷移能力。

圖4 Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Experiment results of Transwell assay

3 討論

有文獻(xiàn)報(bào)道稱，巴爾通體在皮下感染后入侵樹(shù)突狀細(xì)胞，其分泌的效應(yīng)蛋白BepE一定程度上能促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞遷移。而血管內(nèi)皮細(xì)胞是巴爾通體感染的主要靶細(xì)胞，通過(guò)調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞生理功能導(dǎo)致桿菌樣血管瘤形成[11-12]。鑒于血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移與血管瘤生成的顯著相關(guān)性，本研究進(jìn)一步探究漢賽巴爾通體的BepE是否也有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的作用。本研究細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Bhe-ΔBepE、Bhe-pBepE及Bhe野生型三種菌分別感染后，HUVECs的遷移能力與對(duì)照組細(xì)胞相比并無(wú)顯著差異，提示BepE并不具有對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的促遷移能力。但是，研究尚未對(duì)巴爾通體感染內(nèi)皮細(xì)胞后BepE的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)能力進(jìn)行鑒定，無(wú)法排除本研究所用的巴爾通體菌株在細(xì)胞內(nèi)的適應(yīng)性不強(qiáng)，無(wú)法抑制細(xì)胞內(nèi)溶酶體殺傷作用，從而阻礙了BepE細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)。因此我們用包被Bhe-BepE的慢病毒感染HUVECs，通過(guò)Transwell小室實(shí)驗(yàn)直接研究BepE的促血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力研究。結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)Bhe-BepE無(wú)法促進(jìn)HUVECs的遷移。綜上結(jié)果說(shuō)明，巴爾通體BepE自身無(wú)法促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移。但是我們通過(guò)其他實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)巴爾通體BepE能夠有效促進(jìn)細(xì)胞黏著斑的去組裝，因此還需要通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以闡明BepE是否需要與其他效應(yīng)蛋白合作產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，利用其他效應(yīng)蛋白促細(xì)胞收縮能力及其自身的促黏著斑去組裝能力，從而促進(jìn)細(xì)胞遷移。