袁婷，曹錚，劉秀云，鄭波，馮曉莉

0 引言

原發(fā)性縱隔大B 細(xì)胞淋巴瘤（primary mediastinal B-cell lymphoma,PMBL）是一種侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤，占非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin lymphoma,NHL）的2%～3%，多見于3 0～4 0 歲女性[1]。盡管采用了免疫治療方案，10%～30%的PMBL患者仍有復(fù)發(fā)。難治性（relapsed/refractory,RR）疾病需要挽救治療，且效果并不令人滿意[2]。PMBL利用PD-1/PD-L軸抑制抗腫瘤反應(yīng)[3]，抗CD30單抗（brentuximab vedotin,BV）在CD30陽(yáng)性PMBL患者中表現(xiàn)出較好的療效[4]。文獻(xiàn)報(bào)道60%～85%的PMBL表達(dá)CD23，而在非縱隔DLBCL和結(jié)外DLBCL中表達(dá)率較低[5]。GATA3是鑒別PMBL和縱隔經(jīng)典霍奇金淋巴瘤（classic Hodgkin’s lymphoma,CHL）的最有幫助的標(biāo)志物[6]，BCL-2在靜息B細(xì)胞和T細(xì)胞上表達(dá)而在正常生發(fā)中心細(xì)胞上不表達(dá)，相反BCL-6在生發(fā)中心內(nèi)的B和CD4+T細(xì)胞中表達(dá)，MUM1/IRF4和CD138反映了生發(fā)中心內(nèi)B細(xì)胞成熟為漿細(xì)胞的最后步驟，但有關(guān)PMBL中的BCL-6和MUM1表達(dá)情況的研究還較少。與其他淋巴瘤不同，PMBL缺乏預(yù)后生物標(biāo)志物，并且當(dāng)非縱隔原發(fā)的非特指型彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,not otherwise specified,DLBCLNOS）累及縱隔時(shí)，臨床上很難與原發(fā)性縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)行區(qū)分，因此我們選取了非縱隔DLBCL-NOS作為對(duì)照組，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法對(duì)診斷為PMBL、DLBCL-NOS組織中的治療相關(guān)標(biāo)志物PD-L1、PD-L2、CD30及CD23、BCL-2、BCL-6、MUM1、GATA3的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)及分析，探討上述8種蛋白在PMBL診斷和預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值，尋求更具特異性的免疫組織化學(xué)指標(biāo)，提高對(duì)該病的診斷，以期為判斷PMBL預(yù)后提供理論參考進(jìn)而指導(dǎo)臨床個(gè)體化治療。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2000—2019年中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科確診的34例PMBL，對(duì)照組為隨機(jī)抽取的同期31例非縱隔原發(fā)的DLBCL-NOS，取材涵蓋了常見發(fā)病部位。34例PMBL患者有完整的隨訪資料，所有切片均由兩位有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理醫(yī)師獨(dú)立閱片，病理診斷依據(jù)WHO標(biāo)準(zhǔn)（2017版），結(jié)合臨床特點(diǎn)、組織學(xué)形態(tài)、免疫表型及分子診斷，均已明確診斷。本研究所有患者均知情同意。

1.2 病理形態(tài)學(xué)觀察及分級(jí)

1.2.1 制備組織切片 34例PMBL和31例DLBCLNOS的腫瘤組織用4%的中性甲醛固定4～6 h，取1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm的組織塊，5～10倍固定液中固定3～24 h，脫水、過(guò)夜（水洗、脫水、透明、浸蠟），石蠟包埋，切片厚度為3～5 μm，烘烤。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色 采用4 μm厚FFPE組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，免疫組織化學(xué)采用EnVision法。切片經(jīng)過(guò)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后滴加一抗，主要一抗為PD-L1、PD-L2、CD30、CD23、GATA3、BCL-2、BCL-6和MUM1，一抗來(lái)源及陽(yáng)性表達(dá)部位見表1。按廠家說(shuō)明書操作，溫浴30～60 min后滴加二抗，DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，常規(guī)脫水、透明、封片。染色時(shí)每批均包括陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

表1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)一抗來(lái)源及其染色部位Table 1 Source and staining site of immunohistochemical antibody

1.2.3 結(jié)果判讀 PD-L1和PD-L2細(xì)胞膜染色腫瘤細(xì)胞的百分比，見表2。針對(duì)抗體CD23、CD30和GATA3，選取代表區(qū)域計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野下陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比，<10%陽(yáng)性細(xì)胞判為陰性（-），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%且染色弱陽(yáng)性為（+），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%且染色中等陽(yáng)性為（++），陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%且染色強(qiáng)陽(yáng)性為（+++），按照（+）（-）進(jìn)行記錄并分析?？贵wBCL-2、BCL-6和MUM1的截?cái)嘀禐?0%[7]，結(jié)果記錄見表3。本研究中染色細(xì)胞百分率主要由兩位有經(jīng)驗(yàn)的臨床病理專家評(píng)分，平均陽(yáng)性細(xì)胞百分率用于分析，有爭(zhēng)議的病例由第三位臨床病理專家確認(rèn)。標(biāo)志物的診斷指標(biāo)計(jì)算公式：敏感度=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性），特異性=真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性/所有陽(yáng)性，陰性預(yù)測(cè)值=真陰性/所有陰性。

1.3 隨訪

通過(guò)常規(guī)的復(fù)診或電話對(duì)患者進(jìn)行回顧性隨訪。主要研究終點(diǎn)是總生存期（overall survival,OS），其定義為從最初確診到死亡或最后一次隨訪的時(shí)間（2020年11月）。記錄以下隨訪內(nèi)容：病程、治療和預(yù)后情況、隨訪結(jié)束時(shí)的狀況（死亡、存活或失訪）、死亡原因和存活時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各蛋白表達(dá)與PMBL和DLBCL-NOS患者臨床及病理因素的關(guān)系采用卡方檢驗(yàn)；PD-L1、PD-L2和CD30在PMBL和DLBCL-NOS中的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞百分比組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；Kaplan-Meier法進(jìn)行單變量生存分析并繪制生存曲線，Log rank檢驗(yàn)比較生存差異。所有指標(biāo)采用GraphPad Prism 8及SPSS20.0進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 臨床特點(diǎn)

PMBL患者34例，其中男性19例（55.88%），女性15例（44.12%），中位年齡28歲（15～47歲）。隨機(jī)選擇非縱隔原發(fā)的DLBCL-NOS患者31例作為對(duì)照組，其中男20例（64.52%），女性11例（35.48%），中位年齡63歲（年齡17～84歲）。兩組年齡分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在PMBL組中，由縱隔壓迫引起的癥狀是最主要的癥狀，全部34例病例均有大小不等的縱隔腫塊。

2.2 PMBL病理特征

形態(tài)上PMBL腫瘤細(xì)胞彌漫分布，被纖細(xì)或粗大致密膠原分割，呈簇狀、巢團(tuán)狀或結(jié)節(jié)狀排列。腫瘤細(xì)胞中等大或稍大，胞質(zhì)淡染，細(xì)胞核較圓或卵圓形，部分病例中可見Reed-Sternberg樣細(xì)胞，見圖1A、B。PMBL組織形態(tài)上與累及縱隔的DLBCL-NOS有重疊，見圖1C、D，鑒別診斷需要免疫組織化學(xué)標(biāo)志物的輔助。PMBL組中進(jìn)行Ki-67標(biāo)記，陽(yáng)性細(xì)胞比例為30%～80%，其中64.71%（22/34）的病例表達(dá)超過(guò)60%，DLBCLNOS組表達(dá)相似。

圖1 PMBL(A,B)與DLBCL-NOS(C,D)的HE染色 (A,C:×200;B,D:×400)Figure 1 HE staining of PMBL(A,B) and DLBCL-NOS (C,D) (A,C:×200;B,D:×400)

2.3 PMBL與DLBCL-NOS的免疫表型

PMBL組和非縱隔原發(fā)的DLBCL-NOS組中PD-L1、PD-L2、CD30、CD23、BCL-2、BCL-6、MUM1和GATA3的表達(dá)見圖2。PD-L1、PD-L2和CD30在PMBL組陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞百分比的中位數(shù)分別為70%（30%,90%）、25%（0,70%）和17.5%（0,60%），顯著高于DLBCL-NOS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05），見表2。PMBL組CD30陽(yáng)性表達(dá)率為61.76%（21/34），DLBCL-NOS組為12.90%（4/31），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。與DLBCL-NOS組比較，CD30診斷PMBL的特異性為76.47%（13/17），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為84%（21/25），陰性預(yù)測(cè)值為32.50%（13/40）。PMBL組CD23陽(yáng)性率為76.47%（26/34），在DLBCL-NOS組中陽(yáng)性表達(dá)率為9.68%（3/31），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。與DLBCL-NOS組比較，CD23診斷PMBL的特異性為72.73%（8/11），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為89.66%（26/29），陰性預(yù)測(cè)值為22.22%（8/36）。GATA3（P=0.414）、BCL-2（P=0.480）、BCL-6（P=0.659）和MUM1（P=0.601）的表達(dá)在PMBL和DLBCL-NOS組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 CD23、CD30、GATA3、BCL-2、BCL-6和MUM1蛋白在PMBL和DLBCL-NOS中的表達(dá)Table 3 Expression of CD23,CD30,GATA3,BCL-2,BCL-6 and MUM1 proteins in PMBL and DLBCL-NOS groups

圖2 CD23(A)、CD30(B)、GATA3(C)、BCL-2(D)、BCL-6(E)、MUM1(F)、PD-L1(G)和PD-L2(H)在PMBL中的陽(yáng)性表達(dá) (×200)Figure 2 Positive expression of CD23(A),CD30(B),GATA3(C),BCL-2(D),BCL-6(E),MUM1(F),PD-L1(G) and PD-L2(H) in PMBL group (×200)

表2 PD-L1、PD-L2和CD30蛋白在PMBL和DLBCL-NOS中的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞百分比 [M (P25,P75),%]Table 2 Percentage of positive tumor cells with PD-L1,PD-L2 and CD30 expression in PMBL and DLBCL-NOS [M(P25,P75),%]

2.4 PMBL的隨訪與治療

PMBL組有完整隨訪資料的患者28例，失訪6例，隨訪率82.4%。死亡6例（6/28，21.43%），中位生存期為30.5月（4.2～166.1月），總體生存曲線見圖3。5例（5/28，17.86%）單純采用CHOP方案化療，16例（16/28，57.14%）常規(guī)化療結(jié)合利妥昔單抗，1例（1/28，3.57%）PD-1抑制劑聯(lián)合常規(guī)化療4周期后達(dá)到完全緩解（complete response,CR），13例（13/28，46.43%）接受過(guò)放射治療。伴有CD30或BCL-6表達(dá)的PMBL患者其生存曲線盡管P>0.05，但仍顯示出預(yù)后差的趨勢(shì)，見圖4。

圖3 原發(fā)性縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤患者總體生存曲線Figure 3 Overall survival curve of patients with primary mediastinal large B-cell lymphoma

圖4 伴有CD30(A)或BCL-6(B)表達(dá)的PMBL患者的生存曲線Figure 4 Survival curves of PMBL patients with CD30(A)or BCL-6(B) expression

3 討論

原發(fā)性縱隔大B細(xì)胞淋巴瘤起源于胸腺髓質(zhì)B細(xì)胞，是一種發(fā)病率較低但并不罕見的淋巴造血系統(tǒng)疾病，男女比約為1:3。本研究結(jié)果顯示PMBL發(fā)病高峰年齡段為28歲左右，男女性別無(wú)差異，與既往文獻(xiàn)女性患者居多的特點(diǎn)有所不同，而DLBCL-NOS患者多集中于老年人。組織學(xué)上，PMBL的腫瘤細(xì)胞多呈透明細(xì)胞或R-S（Reed-Sternberg）樣細(xì)胞形態(tài)，且穿刺活檢標(biāo)本易擠壓、固定不佳，致使難以識(shí)別而漏診誤診，免疫組織化學(xué)可以協(xié)助診斷。PMBL表達(dá)B細(xì)胞抗原（如CD20，CD79α）和B細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子（如PAX-5、BOB.1、Oct-2等），不表達(dá)表面免疫球蛋白（Ig）和κ、λ[8]。PMBL在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)上不同病例間具有較大的變異，CD30陽(yáng)性率約為80%，個(gè)體差異較大且通常染色強(qiáng)度較弱，CD23陽(yáng)性率約為70%，BCL-2陽(yáng)性率約為55%～80%，BCL-6陽(yáng)性率約為45%～100%[9]。免疫組織化學(xué)研究對(duì)于PMBL和DLBCL-NOS的鑒別診斷必不可少，在本研究中我們探討了治療相關(guān)標(biāo)志物PD-L1、PD-L2、CD30及CD23、BCL-2、BCL-6、MUM1和GATA3在PMBL診斷和預(yù)后評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值，以期為判斷PMBL預(yù)后提供理論參考進(jìn)而指導(dǎo)臨床的個(gè)體化治療。

PD-L1和PD-L2經(jīng)常由于特定的遺傳突變而過(guò)度表達(dá)。PD-L1的表達(dá)具有時(shí)空異質(zhì)性，PD-L1陰性腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)可能變成PD-L1陽(yáng)性腫瘤（反之亦然）。Ventana的sp263 PD-L1用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)時(shí)，建議病理學(xué)家的報(bào)告結(jié)果包括陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞百分比。對(duì)于PD-L2蛋白到目前為止還沒(méi)有得到廣泛的研究。9p24.1染色體異常多見于PMBL，相比之下這種異常在DLBCL中很少見[10-12]。一些研究已經(jīng)表明，PD-L1位點(diǎn)的畸變是PMBL的一個(gè)特征，并且PD-L1的表達(dá)與9p24.1的擴(kuò)增相關(guān)[13]。我們?cè)赑MBL中的研究結(jié)果表明，PD-L1和PD-L2在PMBL組的表達(dá)水平較高，與DLBCL-NOS組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），因此PD-L1和PD-L2免疫組織化學(xué)檢測(cè)可作為鑒別PMBL和DLBCLNOS的輔助實(shí)驗(yàn)手段，有助于識(shí)別更多對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑有反應(yīng)的患者，但尚需進(jìn)一步的前瞻性測(cè)試和驗(yàn)證，以確定免疫檢查點(diǎn)抑制劑在淋巴瘤亞型中的療效?；贙EYNOTE-170研究，帕博利珠單抗獲得美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration,FDA）復(fù)發(fā)/難治性（R/R）PMBL適應(yīng)證批準(zhǔn)。KEYNOTE-170研究中，應(yīng)用帕博利珠單抗治療R/R PMBL，中位隨訪43.1月后，76%的患者治療反應(yīng)持續(xù)時(shí)間（duration of response,DOR）超過(guò)36月，36月無(wú)進(jìn)展生存（progress free survival,PFS）率達(dá)34.2%。因此，帕博利珠單抗單藥治療R/R PMBL顯示出持久的抗腫瘤效應(yīng)且安全可控[3]。另外納武利尤單抗聯(lián)合CD30單抗治療R/R PMBL的Ⅱ期臨床研究也顯示出納武利尤單抗與維布妥昔單抗BV（brentuximab vedotin）的協(xié)同效應(yīng)，其可作為橋接治療方案[4]。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了PD-1/PD-L1軸在調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫方面的重要性，以及在臨床實(shí)踐中靶向這一信號(hào)通路的好處。

CD30在臨床中是一個(gè)非常重要的指標(biāo)，除了淋巴造血系統(tǒng)腫瘤，CD30在非淋巴造血系統(tǒng)腫瘤中也可以表達(dá)。CD30能夠幫助鑒別多種淋巴腫瘤，如霍奇金淋巴瘤（Hodgkin’s lymphoma,HL）、間變大細(xì)胞淋巴瘤（anaplastic cell lymphoma,ALCL）[14]。除此之外，CD30在一些T細(xì)胞淋巴瘤和B細(xì)胞淋巴瘤中都可以表達(dá)，但CD30的專一性、特異性不強(qiáng)，給淋巴瘤的病理診斷帶來(lái)困難，需要結(jié)合形態(tài)以及其他免疫組織化學(xué)標(biāo)記進(jìn)行診斷。PMBL腫瘤細(xì)胞存在CD30高表達(dá)，本組試驗(yàn)結(jié)果亦顯示CD30表達(dá)在PMBL與DLBCL-NOS組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），因此治療相關(guān)標(biāo)志物PD-L1、PD-L2和CD30均有助于區(qū)分PMBL與DLBCL-NOS。BV是一類CD30抗體偶聯(lián)藥物，可通過(guò)抑制微管蛋白合成和細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)CD30陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞凋亡。BV聯(lián)合納武利尤單抗治療R/R PMBL顯現(xiàn)出良好的協(xié)同抗腫瘤活性，客觀緩解率（objective response rate,ORR）達(dá)73%，完全緩解（complete response,CR）率為37%[4]。CD23是一種低親和力的IgE受體，還可作為成熟濾泡B細(xì)胞、活化巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和濾泡樹突狀細(xì)胞上的淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)因子。CD23在PMBL中的表達(dá)率為70%～85%[5,15]，與本研究在PMBL中觀察到的76.47%相符。本研究表明CD23陽(yáng)性有助于PMBL與DLBCL-NOS的鑒別診斷，與既往的結(jié)果[16]一致。PMBL的分子遺傳學(xué)特征中BCL-2和BCL-6基因重排少見，而有研究表明BCL-2表達(dá)是DLBCL的預(yù)后標(biāo)志物[17]。MUM1/IRF4是干擾素和細(xì)胞因子介導(dǎo)基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)劑，在既往的研究中，MUM1與DLBCL的不良預(yù)后相關(guān)[18]，但本研究結(jié)果顯示MUM1表達(dá)對(duì)PMBL的總體生存無(wú)影響，可能與本研究隊(duì)列較小有關(guān)。CD30和BCL-6的預(yù)后價(jià)值值得下一步在更大的患者隊(duì)列中進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，PMBL是一種起源于胸腺的成熟的侵襲性大B細(xì)胞淋巴瘤，具有獨(dú)特的臨床、免疫表型、基因型和分子特征。PMBL中治療相關(guān)標(biāo)志物PD-L1、PD-L2和CD30的表達(dá)水平較高，有助于識(shí)別更多可能對(duì)免疫或靶向治療有反應(yīng)的患者。免疫組織化學(xué)標(biāo)記PD-L1、PD-L2、CD30和CD23有助于PMBL與DLBCL-NOS鑒別診斷，CD30和BCL-6在PMBL的預(yù)后方面顯示了一定的趨勢(shì)，但要作為PMBL的候選預(yù)后指標(biāo)應(yīng)該在更大量的樣本中進(jìn)一步研究。