林華妹，鄒長(zhǎng)棪，蘇穎，胡丹，廖錦容，林可焴，何火聰，鄭雄偉，林賢東,3

0 引言

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，對(duì)人類健康構(gòu)成重大威脅。中國(guó)是胃癌的高發(fā)地區(qū)，發(fā)病率和死亡率持續(xù)上升，并呈顯著的年輕化趨勢(shì)[1]。胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及凋亡等機(jī)制仍未闡明[2-3]，亟需深入探索其生物學(xué)機(jī)制。由于多數(shù)胃癌被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，生存率低，預(yù)后差，因此尋求新的胃癌標(biāo)志物及有效的生物治療靶點(diǎn)是進(jìn)一步改善胃癌預(yù)后的關(guān)鍵。

piRNA是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼小RNA，長(zhǎng)25～31 nt，因與PIWI蛋白結(jié)合故命名為piRNA。通過與PIWI蛋白相互作用而發(fā)揮作用，其與保持基因組穩(wěn)定性、調(diào)節(jié)表觀遺傳學(xué)、生殖干細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育和多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。近年有關(guān)piRNA與腫瘤的相關(guān)性已成為研究熱點(diǎn)[5]。前期有實(shí)驗(yàn)通過測(cè)序技術(shù)篩選到多個(gè)胃癌特異性piRNAs,piR-9994便為其中之一[6]；piR-9994在胃癌組織中過表達(dá)，并與腫瘤分期和神經(jīng)侵犯密切相關(guān)[7]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)piR-9994在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)，通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)明確其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、周期及侵襲的影響，探討piR-9994與胃癌生物學(xué)機(jī)制的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑

人胃癌細(xì)胞株MGC803和AGS購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享平臺(tái)，正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫，HyClone DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基（美國(guó)GE公司），胎牛血清（FBS,美國(guó)Gibco公司），RNeasy Mini Kit（德國(guó)Qiagen公司），PCNA、CCND1（CyclinD1）、Bcl-2、c-PARP、N-cadherin、MMP7、Twist、Vimentin、E-cadherin、β-actin、抗兔/鼠HRP標(biāo)記的IgG抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）。Transwell小室（美國(guó)Millipore公司），MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑MCE Thiazolyl Blue（美國(guó)Promega公司）。MiDETECTATrackTMmiRNA qRT-PCR Stater Kit、Pir-has-9994單鏈mimics和Pir-has-9994 inhibitor（廣州市銳博生物科技有限公司）。MUSE cell cycle Kit（美國(guó)Millipore公司）。LipofectamineRnaiMax（美國(guó)Invitrogen公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和Pir-has-9994質(zhì)粒感染

將GES-1、AGS、MGC803細(xì)胞分別培養(yǎng)于包含10%FBS、100 u/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基中，放置在37℃和5%CO2的濕度環(huán)境培養(yǎng)箱中，2～3 d傳代一次，所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞。MGC803細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待每孔細(xì)胞培養(yǎng)至單層60%～80%，將3 μl待轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒（150 μl無血清培養(yǎng)基稀釋）和9 μl Lipofectamine轉(zhuǎn)染試劑（150 μl無血清培養(yǎng)基稀釋）混勻后逐滴加至每孔，輕搖混勻，培養(yǎng)48 h。通過瞬轉(zhuǎn)技術(shù)利用空載質(zhì)粒和過表達(dá)質(zhì)粒建立對(duì)照的MGC803細(xì)胞株（MGC803/NC（過表達(dá)））和高表達(dá)piR-9994的MGC803細(xì)胞株（MGC803/piR-9994-OE），利用空載質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒建立對(duì)照的MGC803細(xì)胞株（MGC803/NC（敲低））和低表達(dá)piR-9994的MGC803細(xì)胞株（MGC803/piR-9994-IN）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將MGC803細(xì)胞、MGC803/NC（過表達(dá)）細(xì)胞和MGC803/piR-9994-OE細(xì)胞/MGC803/NC（敲低）細(xì)胞和MGC803/piR-9994-IN細(xì)胞以5×103個(gè)/孔接種到96孔板中，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共3個(gè)96孔板，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，去掉上清液，加入2 mg/ml的MTT液50 μl，置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育4 h，每孔加入150 μl的二甲基亞酚，振蕩儀上振蕩混勻，用僅含血清的DMEM/高葡萄糖200 μl培養(yǎng)液作為背景消減，用BIO-RADModel680檢測(cè)490 nm的吸光度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 收集MGC803細(xì)胞、MGC803/NC（過表達(dá)）細(xì)胞和MGC803/piR-9994-OE細(xì)胞/MGC803/NC（敲低）細(xì)胞和MGC803/piR-9994-IN細(xì)胞以8×105個(gè)/孔接種到6孔板中，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，放置在37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞單層鋪滿。用無菌的10 μl槍頭沿著直尺在孔正中劃一根從上到下的直線，去掉上清液及漂浮的細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞3次，拍照后，加入5 ml無血清培養(yǎng)基，置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 把各組細(xì)胞濃度調(diào)整為8×105個(gè)/毫升，取100 μl接種于Transwell上室，下方用1 mg/ml的基質(zhì)膠（美國(guó)Millipore公司）進(jìn)行包被，下室用含30%FBS的培養(yǎng)基作為趨化吸引條件，將小室懸掛在24孔板中。置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中孵育48 h，上室細(xì)胞用棉簽擦除，小室用甲醇固定15 min，用0.1%的結(jié)晶紫進(jìn)行染色。隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行觀察，使用×200倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，確定各組細(xì)胞的平均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.4 細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 收集各組細(xì)胞以500個(gè)/孔接種到6孔板中，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，放置在37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14天，期間根據(jù)培養(yǎng)液pH變化適時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見克隆時(shí)，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，PBS液小心浸洗兩次，晾干。甲醇固定15 min，棄甲醇后晾干。Giemsa染液染色10 min，用流水緩慢洗去染液，晾干，計(jì)數(shù)細(xì)胞集落個(gè)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3.5 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 將細(xì)胞在冰上裂解，超聲離心后取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，并進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。2%BSA封閉1 h后分別加入1:1 000稀釋的一抗4℃環(huán)境過夜，1×TBST洗滌3次，加入二抗封閉120 min，1×TBST洗滌3次后ECL發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像系統(tǒng)照相，分析灰度值。

1.3.6 實(shí)時(shí)定量熒光PCR檢測(cè)piR-9994含量 檢測(cè)GES-1、AGS、MGC803細(xì)胞、MGC803/NC（過表達(dá)）細(xì)胞和MGC803/piR-9994-OE細(xì)胞/MGC803/NC（敲低）細(xì)胞和MGC803/piR-9994-IN細(xì)胞piR-9994含量。收集常規(guī)培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA。利用熒光定量qRT-PCR（miDETECT A TrackTMmiRNA qRTPCR Starter Kit試劑盒）進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟簡(jiǎn)述如下：取2 μl cDNA進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃ 10 min；95℃2 s，60℃ 20 s，70℃10 s，40個(gè)循環(huán)；進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)。每個(gè)樣本重復(fù)3次取平均值。以5S為內(nèi)參基因。mRNA的相對(duì)定量用2-ΔΔCt法。piR-9994和5S引物購(gòu)自廣州銳博公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。配對(duì)資料的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；兩組間比較先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性分析，后進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR檢測(cè)胃癌細(xì)胞系中piR-9994的表達(dá)情況及piR-9994過表達(dá)、敲低的MGC803細(xì)胞的構(gòu)建

結(jié)果顯示piR-9994在MGC803和AGS細(xì)胞中的表達(dá)水平高于GES-1（P<0.001），見圖1A。根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)研究選擇MGC803細(xì)胞系進(jìn)行過表達(dá)/敲低實(shí)驗(yàn)。piR-9994在MGC803/piR-9994-OE表達(dá)水平顯著高于MGC803/NC（過表達(dá)）（P<0.001），見圖1B。piR-9994在MGC803/piR-9994-IN表達(dá)水平顯著低于MGC803/NC（敲低）（P<0.0001），見圖1C。以上結(jié)果表明MGC803/piR-9994-OE和MGC803/piR-9994-IN胃癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。

圖1 piR-9994在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)以及構(gòu)建piR-9994過表達(dá)或敲除MGC803細(xì)胞株Figure 1 Expression of piR-9994 in gastric cancer cell lines and construction of MGC803 cell line with piR-9994 overexpression or knockdown

2.2 piR-9994過表達(dá)/敲低對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響

MTT結(jié)果顯示，相比對(duì)照組MGC803/NC（過表達(dá)）,MGC803/piR-9994-OE細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)（P<0.01），見圖2A。細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MGC803/piR-9994-OE細(xì)胞形成集落數(shù)顯著高于MGC803/NC（過表達(dá)）（32.78±2.75vs.70.56±4.92,P=0.0026），見圖2B。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MGC803/piR-9994-OE細(xì)胞遷移能力高于MGC803/NC（過表達(dá)），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖2C～D。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MGC803/piR-9994-OE細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)增加，明顯高于MGC803/NC（過表達(dá)）（122.80±2.28vs.168.60±2.45,P=0.0002），見圖2E。以上結(jié)果表明，piR-9994過表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移。

圖2 piR-9994過表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞增殖生長(zhǎng)和遷移侵襲的影響Figure 2 Effect of piR-9994 overexpression on proliferation,migration and invasion of MGC803 cells

MTT結(jié)果顯示，相比對(duì)照組MGC803/NC（敲低），MGC803/piR-9994-IN細(xì)胞增殖能力顯著減弱（P<0.05），見圖3A。細(xì)胞集落實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MGC803/piR-9994-IN細(xì)胞形成集落數(shù)低于MGC803/NC（敲低）（30.67±3.22vs.13.56±0.40,P=0.0062），見圖3B。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MGC803/piR-9994-IN細(xì)胞遷移能力相比于MGC803/NC（敲低）顯著下降（P<0.01），見圖3C～D。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MGC803/piR-9994-IN細(xì)胞穿膜個(gè)數(shù)減少，顯著低于MGC803/NC（敲低）（149.1±7.50vs.85.07±2.28,P=0.0012），見圖3E。以上結(jié)果表明，piR-9994敲低可抑制胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

圖3 piR-9994的敲低對(duì)MGC803細(xì)胞增殖生長(zhǎng)和遷移侵襲的影響Figure 3 Effect of piR-9994 knockdown on proliferation,migration and invasion of MGC803 cells

2.3 piR-9994對(duì)胃癌細(xì)胞周期影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，MGC803/piR-9994-OE組S期細(xì)胞百分比明顯高于MGC803/NC（過表達(dá)），見圖4A（P<0.05），而MGC803/piR-9994-IN組S期細(xì)胞百分比明顯低于MGC803/NC（敲低），見圖4B（P<0.05）。S期為DNA復(fù)制期，提示piR-9994表達(dá)與細(xì)胞周期密切相關(guān)，piR-9994異常表達(dá)可能導(dǎo)致周期改變。

2.4 piR-9994對(duì)細(xì)胞增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響

qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，在MGC803/piR-9994-OE中PCNA、CCND1、Bcl-2表達(dá)水平顯著高于MGC803/NC（過表達(dá)）（P<0.01），c-PARP表達(dá)水平低于MGC803/NC（過表達(dá)）（P<0.001）。而在MGC803/piR-9994-IN中PCNA、CCND1、Bcl-2表達(dá)水平顯著低于MGC803/NC（敲低）（P<0.05），c-PARP表達(dá)水平高于MGC803/NC（敲低）（P<0.05），見圖4。PCNA、CCND1、Bcl-2表達(dá)與細(xì)胞增殖正相關(guān)，c-PARP表達(dá)與細(xì)胞增殖負(fù)相關(guān)，以上結(jié)果提示piR-9994促進(jìn)MGC803細(xì)胞增殖和抑制其凋亡。

圖4 piR-9994表達(dá)對(duì)MGC803細(xì)胞周期和增殖相關(guān)基因表達(dá)的影響Figure 4 Effect of piR-9994 expression on cell cycle and proliferation-related genes expression of MGC803 cells

2.5 piR-9994對(duì)胃癌細(xì)胞EMT進(jìn)展的影響

結(jié)果顯示：piR-9994過表達(dá)時(shí)，N-cadherin、MMP7、Twist和Vimentin高表達(dá)，E-cadherin低表達(dá)（P<0.05），見圖5A～C；piR-9994敲低時(shí)，E-cadherin高表達(dá)，N-cadherin、MMP7、Twist和Vimentin低表達(dá)（P<0.05），見圖5D～F。以上結(jié)果表明，piR-9994過表達(dá)增加細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及侵襲、轉(zhuǎn)移能力，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT現(xiàn)象。

圖5 piR-9994表達(dá)與MGC803細(xì)胞EMT相關(guān)基因表達(dá)的關(guān)系Figure5 Relation between piR-9994 expression and EMT-related genes expression in MGC803 cells

3 討論

piRNA是一種特異性表達(dá)的內(nèi)源性小分子RNA，長(zhǎng)25～31nt，與PIWI蛋白結(jié)合形成piRNA/PIWI復(fù)合物，影響轉(zhuǎn)座子沉默、精子發(fā)生、基因重排、表觀遺傳調(diào)控、蛋白質(zhì)調(diào)控和生殖干細(xì)胞維持。研究表明piRNA在乳腺癌、食管癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、腎母細(xì)胞瘤等多種實(shí)體腫瘤中有差異表達(dá)[7-10]；食管癌中piR-823通過異常的DNA甲基化產(chǎn)生致癌作用，且與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。非小細(xì)胞肺癌中piR-651異常表達(dá)與腫瘤進(jìn)展有關(guān)，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)表明piR-651的過表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。

本項(xiàng)目的前期研究通過測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建piRNA在胃癌中的表達(dá)譜，同時(shí)篩選出50個(gè)在胃癌及癌旁組織中有差異性表達(dá)的piRNAs，其中17個(gè)在胃癌組織中高表達(dá)，33個(gè)低表達(dá)，piR-9994為高表達(dá)的piRNA之一[6]；進(jìn)一步通過大樣本胃癌組織標(biāo)本分析表明，piR-9994在胃癌組織高表達(dá)，piR-9994在胃癌組織中的表達(dá)比癌旁組織上調(diào)2.3倍（P=0.002），而且與腫瘤分期、神經(jīng)侵犯密切相關(guān)（P<0.05）[7]。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建piR-9994過表達(dá)與敲低的胃癌細(xì)胞株MGC803，進(jìn)行生物學(xué)功能研究。研究表明，piR-9994過表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，而piR-9994敲低抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。同時(shí)piR-9994與細(xì)胞周期密切相關(guān)。以上結(jié)果，從組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)層面分析表明，piR-9994參與胃癌發(fā)展進(jìn)程并發(fā)揮重要作用。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition,EMT）是指上皮細(xì)胞失去其頂端-基底極性和細(xì)胞間黏附特性，轉(zhuǎn)變成具有侵襲性的間充質(zhì)細(xì)胞的過程。大量研究表明EMT是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制之一，與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[12]，EMT的激活使胃癌上皮細(xì)胞具有間質(zhì)細(xì)胞的特征，上皮極性減少，而且間質(zhì)細(xì)胞獲得干細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、抗凋亡及耐藥等特征。前期研究工作顯示，piR-9994在胃癌組織中異常表達(dá)與EMT密切相關(guān)[13]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，piR-9994過表達(dá)胃癌細(xì)胞組中Twist、N-cadherin、MMP-7、Vimentin高表達(dá)，而E-cadherin低表達(dá)。piR-9994敲低胃癌細(xì)胞組中Twist、N-cadherin、MMP-7、Vimentin低表達(dá)，而E-cadherin高表達(dá)。以上結(jié)果表明，piR-9994異常表達(dá)影響EMT進(jìn)程，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，piR-9994參與胃癌發(fā)展進(jìn)程并發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)影響胃癌細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及EMT進(jìn)程。piR-9994可能是胃癌的新的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。