閻潔，余雪巍，李鑒博，顧海萍，郭二輝

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002

近年來，由于工業(yè)化的快速發(fā)展，多環(huán)芳烴（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）成為水體、土壤等環(huán)境中最主要的持久性有機(jī)污染物之一（Seo et al.，2009）。PAHs是由兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)以線狀、角狀、簇狀排列在一起的稠環(huán)形化合物，具有致癌、致畸、致突變效應(yīng)和難降解性，主要來源于化石燃料的不完全燃燒、采油等工業(yè)過程（顧海萍，2016）。由于PAHs本身具有高度親脂的特性，環(huán)境中低濃度的PAHs可通過食物鏈的生物放大作用威脅人體健康（Abd-Elsalam et al.，2009），PAHs污染的修復(fù)迫在眉睫。目前PAHs污染修復(fù)技術(shù)主要包括物理法、化學(xué)法和生物法3種，其中物理法有蒸汽抽提、熱脫附、超聲波、隔離法和換土法等，化學(xué)法有光催化法、濕式氧化法、電化學(xué)氧化法和化學(xué)淋洗法等，這些物理化學(xué)修復(fù)方法不僅成本高昂、修復(fù)不徹底還可能造成二次污染（錢翌等，2013）。生物修復(fù)是利用微生物自身的生長(zhǎng)代謝來降解有機(jī)污染物的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法，它具有可持續(xù)性和環(huán)境友好性（Masakorala et al.，2013）。然而，PAHs在環(huán)境中難溶、生物可利用性低是限制微生物修復(fù)有機(jī)污染物的關(guān)鍵問題（Xia et al.，2014）。生物表面活性劑是微生物生長(zhǎng)代謝產(chǎn)生的一類同時(shí)含有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)的大分子化合物（Sun et al.，2019），因其能夠提高PAHs的生物可利用性而受到廣泛關(guān)注（Pacwa-Plociniczak et al.，2016）。但是生物表面活性劑產(chǎn)量低、純化難、生產(chǎn)成本高，使其在PAHs污染修復(fù)中推廣困難，促使直接篩選產(chǎn)生生物表面活性劑的PAHs降解菌株成為新的研究思路（Xu et al.，2020）。

由3個(gè)稠合苯環(huán)組成的菲已被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署（USEPA）列為優(yōu)先污染物，它具有PAHs的典型結(jié)構(gòu)——k區(qū)和灣區(qū)，常被作為PAHs降解研究的模式化合物（Seo et al.，2009）。張俊葉等（2017）的研究顯示，與其他國(guó)家相比，我國(guó)表層土壤中USEPA優(yōu)先控制的16種PAHs以菲的含量最高，這嚴(yán)重威脅到我國(guó)的糧食安全和國(guó)民健康。因此，本研究選取菲作為目標(biāo)污染物，從河南省信陽市一處多年垃圾焚燒場(chǎng)地中篩選分離出一株既能降解菲又能產(chǎn)生生物表面活性劑的細(xì)菌 GHP1，評(píng)價(jià)了該菌株的菲降解能力，鑒定了菌株所產(chǎn)生的生物表面活性劑類型，探討了菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的最佳生長(zhǎng)條件，為PAHs污染微生物修復(fù)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

本實(shí)驗(yàn)篩選菌株的土壤采自河南省信陽市一處有 50年歷史的垃圾焚燒場(chǎng)地（32.241°N，114.499°E），采樣深度為0—15 cm的表層土壤，土樣自然風(fēng)干后過2 mm篩，并于4 ℃下保存。根據(jù)中國(guó)農(nóng)業(yè)化學(xué)委員會(huì)（1983）的方法分析該土壤的基本理化性質(zhì)如下：pH、有機(jī)物和陽離子交換容量分別為 6.5、14.1 g·kg?1和 26.4 cmol·kg?1，機(jī)械組成為49.1%的沙粒、14.2%的粉粒和36.7%的粘粒。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

菲（純度>99%，Sigma-Aldrich，上海），4000 mg·L?1的菲母液（丙酮溶），實(shí)驗(yàn)中其他有機(jī)試劑均為色譜純，無機(jī)化學(xué)試劑均為分析純。

LB培養(yǎng)基：10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g NaCl，1000 mL蒸餾水，pH 7.2，固體LB需添加 1.5%瓊脂。無機(jī)礦質(zhì)培養(yǎng)基（MSM）：1 g KH2PO4，0.5 g NaNO3，0.2 g MgSO4，0.5 g(NH4)2SO4，0.02 g CaCl2，1 g NaH2PO4·H2O，1000 mL蒸餾水，pH 6.5，固體MSM需添加1.5%瓊脂。所有培養(yǎng)基用前均經(jīng)過 121 ℃高壓蒸汽滅菌處理15 min。

1.3 菲降解和產(chǎn)生生物表面活性劑菌株的篩選

吸取2.5 mL菲母液于250 mL的錐形瓶?jī)?nèi)并使丙酮揮發(fā)形成菲膜，再加入 100 mL滅菌的液體MSM，使菲的初始濃度為100 mg·L?1。稱取10 g土壤樣品于錐形瓶中，在 28 ℃、130 r·min?1的條件下震蕩培養(yǎng)一周，該過程為第一次馴化。然后，將10 mL瓶?jī)?nèi)溶液轉(zhuǎn)移到新的含菲膜的錐形瓶中，添加90 mL滅菌的液體MSM，繼續(xù)培養(yǎng)一周，相同的操作再循環(huán)一次。3次馴化完成后，移取第3次馴化培養(yǎng)的溶液于無菌管中，梯度稀釋至 10?3、10?4、10?5、10?6后分別吸取 500 μL 涂布到覆有菲膜的MSM瓊脂平板上，在28 ℃條件下避光培養(yǎng)。每日觀察，挑出菌落周圍有透明降解圈的單菌落在含菲膜的MSM瓊脂平板上多次劃線純化，得到的純菌即為菲降解菌（Wang et al.，2016）。采用試管斜面保藏菌種，置于4 ℃下留用。

檢測(cè)菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的方式多樣，如血平板法、液滴坍塌法、表面張力法和排油圈法等（Kumar et al.，2016；Xu et al.，2020）。其中，一些菌株本身就含有溶血活性的毒力因子或者產(chǎn)生的生物表面活性劑擴(kuò)散性差、產(chǎn)量不高從而導(dǎo)致血平板法、液滴坍塌法判斷不準(zhǔn)確（Pacwa-Plociniczak et al.，2016）。而排油圈法直觀的反映菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的能力（畢思寧等，2009），培養(yǎng)液表面張力的降低則能進(jìn)一步驗(yàn)證菌株產(chǎn)生生物表面活性劑（Mouafo et al.，2018）。因此，本研究采取排油圈法和表面張力測(cè)定法篩選能夠產(chǎn)生生物表面活性劑的菌株。排油圈法：將50 mL去離子水加入到直徑為9 cm的培養(yǎng)皿中，并滴加1 mL已被蘇丹紅Ⅲ染色的液體石蠟，將20 μL已離心去除菌體的培養(yǎng)液滴加在油膜中心，油膜被向外擠壓從而形成一個(gè)圓圈即為排油圈，以不接種菌株的液體培養(yǎng)基為對(duì)照（畢思寧等，2009）。表面張力測(cè)定法：接種菌株于液體LB培養(yǎng)基中，在28 ℃，130 r·min?1條件下培養(yǎng) 72 h，然后 10000 r·min?1離心 20 min 去除菌體，用表面張力儀測(cè)定去除菌體后培養(yǎng)液的表面張力（Xu et al.，2020）。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 菌株的形態(tài)特征

本研究將篩選出來的目標(biāo)菌株命名為 GHP1，將該菌株單菌落接種于固體 LB平板上培養(yǎng) 72 h（28 ℃），觀察菌落生長(zhǎng)形態(tài)特征；與此同時(shí)，挑取單菌落接種于液體LB中，并在28 ℃、130 r·min?1條件下培養(yǎng)48 h，觀察菌液生長(zhǎng)情況。菌體革蘭氏屬性采用革蘭氏染色法并在普通光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)使用透射電子顯微鏡觀察。

1.4.2 菌株的生理生化特征

甲基紅反應(yīng)、過氧化氫酶活性、纖維素水解、淀粉水解等生理生化指標(biāo)參考相關(guān)文獻(xiàn)（東秀珠等，2001）進(jìn)行測(cè)定，運(yùn)動(dòng)性采用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法驗(yàn)證（Rashid et al.，2000），菌體表面的疏水性用菌體與水之間的接觸角（θw）來表征（顧海萍，2016），V-P反應(yīng)、吲哚產(chǎn)生、H2S產(chǎn)生、明膠水解、檸檬酸利用、β-半乳糖苷酶、脲酶、精氨酸雙水解酶、色氨酸脫氨酶活性通過API20E分析，由北京麥克羅科技有限公司完成。

1.4.3 16S rDNA序列鑒定

用DNA抽提試劑盒提取GHP1菌株的DNA，選用16S rDNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCC TGGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增（石金禮等，2016），PCR產(chǎn)物進(jìn)行 1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證后交由派森諾基因生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將獲得的序列結(jié)果在 NCBI數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中進(jìn)行 BLAST比對(duì)，采用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，通過Neighborjioning方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap進(jìn)行1000次重復(fù)檢驗(yàn)（Deng et al.，2020）。

1.5 菌株對(duì)菲的降解

接種GHP1菌株于LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、130 r·min?1條件下培養(yǎng) 24 h，離心（8000 r·min?1，4 ℃）5 min后倒掉上清液，收集的菌體用液體MSM洗滌兩次并重新懸浮，然后采用紫外分光光度計(jì)調(diào)節(jié)菌懸液的OD600nm值為1.0，待用。

在滅菌棕色玻璃管中加入適量的菲母液，待丙酮揮發(fā)完全，加入9 mL滅菌的液體MSM和1 mL已制備好的菌懸液，使體系中菲的理論初始濃度為100 mg·L?1。將棕色玻璃瓶在 28 ℃、130 r·min?1下培養(yǎng)，每48 h在超凈工作臺(tái)中曝氣1 min。分別在0、12、24、48、72 h取樣，根據(jù)Wang et al.（2016）研究中的方法提取、測(cè)定體系中菲的殘余量。以未接菌的含菲液體MSM為對(duì)照，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程 C=C0×e?kt擬合菲的降解數(shù)據(jù)。其中，t1/2為菲的半衰期，即菲濃度降到50%所耗費(fèi)的時(shí)間t1/2=ln(2)/k，C0是菲的初始質(zhì)量濃度，C是溶液中菲在培養(yǎng)t時(shí)間時(shí)的殘留質(zhì)量濃度，k是一級(jí)動(dòng)力學(xué)常數(shù)（Gu et al.，2021）。

1.6 生物表面活性劑的提取及鑒定

1.6.1 生物表面活性劑的提取及純化

接種菌株GHP1于液體LB培養(yǎng)基中，在28 ℃、130 r·min?1條件下培養(yǎng) 72 h，離心（4 ℃，10000 r·min?1，20 min）獲得無細(xì)胞的上清液，然后用 6 mol·L?1鹽酸將上清液酸化至 pH 2.0，并在 4 ℃下儲(chǔ)存過夜。再次在相同條件下離心收集沉淀物，該沉淀物即為生物表面活性劑的粗產(chǎn)物（Xia et al.，2014）?；?Batool et al.（2017）和 He et al.（2017）的方法提純生物表面活性劑，將粗品溶于氯仿/甲醇（V∶V=2∶1）溶劑中，使得粗品與溶劑的比為 1∶30，超聲30 min后攪拌并過濾，棄掉過濾的殘?jiān)芤航?jīng)氮吹后再冷凍干燥，即得純品。

1.6.2 薄層層析

將0.01 g提取的生物表面活性劑溶解在1 mL的氯仿/甲醇（V∶V=8∶2）中，超聲10 min至完全溶解，點(diǎn)樣于硅膠60板（GF254）上進(jìn)行薄層層析，用氯仿/甲醇/水（V∶V∶V=4∶3∶2）作為流動(dòng)相展層（馬斌斌等，2017），展層完成后進(jìn)行顯色反應(yīng)。本研究使用的顯色劑為茚三酮試劑，由溶解在100 mL正丁醇中的1.5 g茚三酮和3.0 mL乙酸組成（Xu et al.，2020）。

1.6.3 傅里葉變換紅外光譜

取約 1.0 mg研磨過的冷凍干燥后的生物表面活性劑粉末與100 mg干燥的KBr粉末研磨均勻，用壓片機(jī)壓成幾乎呈透明狀原片后于 4000—500 cm?1光區(qū)進(jìn)行紅外光譜掃描（Habib et al.，2020）。

1.7 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株產(chǎn)生生物表面活性劑能力的影響

測(cè)定在不同培養(yǎng)時(shí)間、溫度、pH、碳源條件下菌株培養(yǎng)液乳化指數(shù)（E24）的大小，以探究不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株產(chǎn)生表面活性劑能力的影響。所有實(shí)驗(yàn)均在50 mL的錐形瓶中進(jìn)行，液體培養(yǎng)基為20 mL，各處理設(shè)置3組重復(fù)。E24參照Sun et al.（2019）的方法進(jìn)行測(cè)定，即取已去除菌體的菌株培養(yǎng)液和液體石蠟各5 mL分別加入尖頭離心管中，漩渦震蕩2 min混合均勻，室溫靜置24 h后測(cè)量其乳化層高度，并按照下式計(jì)算E24：

式中：

he——乳化層高度（cm）；

h——液體總高度（cm）。

1.7.1 培養(yǎng)時(shí)間

將制備好的菌懸液按 1∶9（V∶V）接種以蔗糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）為唯一碳源的液體MSM，pH為6.5，在28 ℃、130 r·min?1條件下振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)的24、72、120、168 h取樣，測(cè)定菌株培養(yǎng)液的E24。

1.7.2 溫度

將制備好的菌懸液按 1∶9（V∶V）接種以蔗糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）為唯一碳源的液體MSM，pH為6.5，分別設(shè)置培養(yǎng)溫度為 20、28、37 ℃，在 130 r·min?1條件下培養(yǎng)72 h，取樣測(cè)定菌株培養(yǎng)液的E24。

1.7.3 pH

將制備好的菌懸液按1∶9（V∶V）接種以蔗糖（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%）為唯一碳源的液體MSM，分別設(shè)置培養(yǎng)基的初始pH為5.0、6.5、8.0、9.0、10.0，在28 ℃、130 r·min?1條件下培養(yǎng) 72 h，取樣測(cè)定菌株培養(yǎng)液的E24。

1.7.4 碳源

在pH為6.5的液體MSM培養(yǎng)基中加入8種碳源，其中蔗糖、玉米淀粉、柴油、菜籽油、潤(rùn)滑油、石蠟、甘油按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%添加；菲的添加量為100 mg·L?1（預(yù)實(shí)驗(yàn)表明GHP1菌株在此濃度下生長(zhǎng)最佳）。然后按1∶9（V∶V）接種制備好的菌懸液，在 28 ℃、130 r·min?1條件下培養(yǎng) 72 h，取樣測(cè)定菌株培養(yǎng)液的E24。

2 結(jié)果與討論

2.1 降解菲和產(chǎn)生生物表面活性劑菌株的篩選

在涂滿菲的MSM平板上，如果菌落周圍的菲膜消失不見并出現(xiàn)肉眼清晰可見的透明圈，說明污染物菲被菌株降解，此透明圈即為透明降解圈（羅小艷，2015）。透明降解圈反映了菌株具有利用菲的能力，常作為初步篩選菲降解菌的快速方法（Wang et al.，2016）。微生物對(duì)于污染物的降解需要一定的適應(yīng)期，產(chǎn)生透明降解圈的速度越快，說明菌株對(duì)污染物的適應(yīng)能力越強(qiáng)，降解速度越快（羅小艷，2015）。在初步篩選階段，涂布到覆著菲膜的MSM平板上的菌懸液培養(yǎng)一周后出現(xiàn)清晰可見且形態(tài)不一的單菌落，挑取周圍有透明降解圈的單菌落轉(zhuǎn)接到新的覆有菲膜的MSM平板上，多次進(jìn)行分離純化，最后純化出8株細(xì)菌。其中，GHP1菌株產(chǎn)生透明降解圈（圖1）的速度最快，培養(yǎng)72 h即可將平板上的菲（0.4 mg）利用完全，這說明GHP1菌株能降解污染物菲，且降解能力突出。

圖1 GHP1菌落在覆有菲的MSM平板上產(chǎn)生的透明降解圈

產(chǎn)生排油圈說明菌株產(chǎn)生生物表面活性劑，排油圈的直徑與表面活性劑含量成正比（Hentati et al.，2021）。為確定GHP1菌株是否產(chǎn)生生物表面活性劑，本實(shí)驗(yàn)對(duì)去除GHP1菌體后的培養(yǎng)液進(jìn)行排油圈實(shí)驗(yàn)，并以滅菌的液體LB培養(yǎng)基作為空白對(duì)照。結(jié)果顯示，相對(duì)于液體LB，去除GHP1菌體后的培養(yǎng)液排油圈清晰可見（圖2），這說明GHP1菌株能產(chǎn)生生物表面活性劑。

圖2 液體LB培養(yǎng)基（A）、菌株GHP1培養(yǎng)液（B）的排油圈Fig. 2 Oil displacement circle of liquid LB medium (A) and strain GHP1 culture solution (B)

表面活性劑是一種能降低表面張力的物質(zhì)（Mouafo et al.，2018）。據(jù)此，通過檢測(cè)菌株培養(yǎng)液的表面張力能篩選產(chǎn)生生物表面活性劑的菌株。在表面張力實(shí)驗(yàn)中，GHP1菌株在液體LB中培養(yǎng)72 h的培養(yǎng)液表面張力為53 mN·m?1，比對(duì)照液體LB的表面張力（74 mN·m?1）降低了28.38%，該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了GHP1菌株能產(chǎn)生生物表面活性劑這一結(jié)論。

綜上所述，GHP1菌株能夠降解菲且能產(chǎn)生生物表面活性劑，因此選取該菌株作為供試菌株進(jìn)一步研究。

2.2 菌株鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)特征

GHP1菌株在液體 LB培養(yǎng)基中 28 ℃、130 r·min?1條件下振蕩培養(yǎng)逐漸變渾濁，30 h后呈現(xiàn)菌團(tuán)聚物（圖3A）。菌株在固體LB上生長(zhǎng)迅速，長(zhǎng)勢(shì)良好，48 h便可形成清晰可見的菌落，菌落呈黃色，不透明，表面狀態(tài)光滑有光澤，菌落隆起，邊緣結(jié)構(gòu)整齊，質(zhì)地粘稠（圖 3B）。GHP1菌株革蘭氏染色顯示為紅色，表明其為革蘭氏陰性菌（圖3C）。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，GHP1菌體為桿狀，無芽孢，有單端鞭毛（圖3D），可能為運(yùn)動(dòng)型細(xì)菌（Bruzaud et al.，2015）。污染物的降解取決于降解微生物與污染物之間的有效接觸（Semple et al.，2003），鞭毛則可增加菌株對(duì)高疏水性物質(zhì)表面的粘附（Bruzaud et al.，2015）。Gu et al.（2017）的研究表明，有單端鞭毛的運(yùn)動(dòng)型PAHs降解細(xì)菌能夠增加其與PAHs的接觸機(jī)會(huì)，提高PAHs的生物可利用性，從而增強(qiáng)PAHs的降解能力。本實(shí)驗(yàn)中，GHP1菌株具有單端鞭毛的特性有利于其對(duì) PAHs的降解。

圖3 GHP1在液體（A）、固體（B）LB培養(yǎng)基中的菌體形態(tài)和光學(xué)顯微鏡下的革蘭氏染色（C）以及透射電子顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)（D）Fig. 3 Morphology of strain GHP1 in liquid (A), solid (B) LB medium, gram staining under light microscope (C)and cell morphology under transmission electron microscope (D)

2.2.2 菌株的生理生化特征

GHP1菌株的生理生化特征測(cè)定結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，GHP1是一株運(yùn)動(dòng)型細(xì)菌，這也與之前透射電鏡下該菌株具有單端鞭毛的結(jié)果（圖3D）相吻合。另外，過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)反應(yīng)為陽性，說明GHP1菌株含有過氧化氫酶，許多研究指出能產(chǎn)生過氧化氫酶是微生物降解有機(jī)污染物的關(guān)鍵（李雪，2018）。此外，該菌株需氧，能水解淀粉；β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)反應(yīng)為陽性；V.P.實(shí)驗(yàn)為弱陽性；其他反應(yīng)則為陰性。

表1 GHP1菌株的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain GHP1

根據(jù)GHP1菌株表面與水的接觸角（θw），可判斷該菌株表面呈中度親水性。PAHs是脂溶性有機(jī)污染物，若菌體表面高度親水，則不利于微生物對(duì)PAHs的攝取和降解（顏湘波等，2014）。本研究中，GHP1屬于中度親水性菌株，對(duì)PAHs的攝取和利用阻礙不大。

2.2.3 菌株的分子學(xué)鑒定

利用細(xì)菌16S rDNA的通用引物對(duì)菌株GHP1進(jìn)行擴(kuò)增，最終得到1366 bp的基因序列（GenBank登錄號(hào)為 MW345956）。將 16S rDNA基因序列在GenBank上進(jìn)行序列同源性比較，結(jié)果表明菌株GHP1的16S rDNA基因與Sphingobium abikonense MS64的16S rDNA基因相似度高達(dá)100%，與Sphingobium lactosutens DS20、Sphingobium abikonense NBRC 16140、Sphingobium soli THG-SQA7、Sphingobium abikonense IAM 12404、Sphingobium amiense NBRC 102518以及Sphingobium amiense Y的16S rDNA基因相似度均在97.81%以上。對(duì)其進(jìn)行發(fā)育樹的構(gòu)建如圖4所示，從結(jié)果可以看出菌株GHP1與菌株Sphingobium abikonense MS64聚于一類，親緣關(guān)系最近。

圖4 基于菌株GHP1與相似菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain GHP1 and related type strains

綜合形態(tài)觀察、生理生化特征和分子學(xué)鑒定結(jié)果，GHP1菌株為 Sphingobium abikonense （S.abikonense）。近些年來，從環(huán)境中分離出一些能降解 PAHs的 Sphingobium屬菌株（Prakash et al.，2006；Dong et al.，2014）中并無 Sphingobium abikonense的相關(guān)研究。因此，進(jìn)一步研究 Sphingobium abikonense GHP1對(duì)菲的降解以及產(chǎn)生生物表面活性劑的特性具有非常重要的參考價(jià)值。

2.3 菌株對(duì)菲的降解

菌株GHP1作用下菲殘余率的動(dòng)態(tài)變化如圖5所示。菲的殘余率隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而迅速降低，其中，培養(yǎng)24 h菲的殘余率為70.93%，培養(yǎng)結(jié)束時(shí)（72 h）菲的殘余率為 13.92%，該變化符合一階動(dòng)力學(xué)模型（R2=0.859），t1/2約為27.12 h，說明菲降解50%所需要的時(shí)間是27.12 h（表2）。目前已被報(bào)道的菲降解菌株及其菲降解能力如表3所示，從該表可知，不同屬的菌株對(duì)菲的降解能力有差異，其中Sphingobium屬菌株的降解能力最強(qiáng)，本文的研究對(duì)象GHP1菌株隸屬于該屬。

圖5 GHP1菌株對(duì)菲的降解動(dòng)態(tài)Fig. 5 Degradation dynamics of phenanthrene by strain GHP1

表2 GHP1菌株對(duì)菲降解的一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程及半衰期Table 2 First-order kinetics equations and the corresponding half-life times of phenanthrene biodegradation by strain GHP1

表3 菲降解菌株及其降解率統(tǒng)計(jì)表Table 3 Statistical table of phenanthrene degrading strains and their degradation rates

顏湘波等（2014）認(rèn)為，疏水性是影響PAHs微生物降解效果的眾多因素之一。環(huán)境中存在一些中度親水的高效PAHs降解細(xì)菌，Wang et al.（2016）和本文的研究均證實(shí)了此觀點(diǎn)。另外，GHP1菌株具有運(yùn)動(dòng)性，能夠增強(qiáng)菲的生物可利用性，從而提高對(duì)菲的降解能力。綜上可知，GHP1菌株具有高效的菲降解能力，在菲污染的微生物修復(fù)中具有較大的應(yīng)用潛力。

2.4 生物表面活性劑的鑒定

2.4.1 薄層層析

薄層層析是鑒定生物表面活性劑種類的重要方法（馬斌斌等，2017），GHP1菌株所產(chǎn)生的生物表面活性劑經(jīng)過薄層層析展層，噴灑茚三酮試劑在比移值Rf=0.7處顯示紅色斑點(diǎn)（圖6），這說明該生物表面活性劑是脂肽（Habib et al.，2020）。

圖6 GHP1菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑薄層層析Fig. 6 Thin layer chromatography of biosurfactants produced by strain GHP1

2.4.2 傅里葉變換紅外光譜

傅里葉變換紅外光譜能準(zhǔn)確鑒定生物表面活性劑的種類（馬斌斌等，2017），GHP1菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑經(jīng)冷凍干燥后進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜分析，結(jié)果如圖7所示。在3296.75 cm?1處有一較寬的峰，說明該物質(zhì)具有 N-H的伸縮振動(dòng)（馬斌斌等，2017）；在2925.39 cm?1處出現(xiàn)一個(gè)尖銳而狹窄的峰，表明該物質(zhì)具有 C-H的伸縮振動(dòng)（Huang et al.，2020）；在 1657.62 cm?1處出現(xiàn)一個(gè)強(qiáng)有力的峰，屬于C=O和C-N的伸縮振動(dòng)，即酰胺I帶，這證實(shí)了生物表面活性劑分子中存在肽基（Habib et al.，2020）；1535.25 cm?1處的峰意味著酰胺II帶的存在，是N-H彎曲和C-N伸縮振動(dòng)的組合吸收（Kumar et al.，2016）；1226.27 cm?1處的小峰為C-H的伸縮振動(dòng)（曾超等，2020）；1064.65 cm?1處的小峰為C-O-C的伸縮振動(dòng)（Padmavathi et al.，2014）。該結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了GHP1菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑為脂肽類物質(zhì)，親水基為肽鏈。

圖7 GHP1菌株產(chǎn)生的表面活性劑紅外吸收光譜Fig. 7 Infrared absorption spectra of biosurfactants produced by strain GHP1

目前，已報(bào)道的能產(chǎn)生生物表面活性劑的菌株以及產(chǎn)生的生物表面活性劑種類十分豐富。例如：Pseudomonas aeruginosa 147、Enterobacter sp. SF-4、Lactobacillus plantarum G88能產(chǎn)生糖脂類表面活性劑（Batool et al.，2017；Mouafo et al.，2018；石金禮等，2016）；Serratia marcescens ZCF25、Bacillus siamensis ZCST-1、Staphylococcus sp. CO100能產(chǎn)生脂肽類表面活性劑（Huang et al.，2020；Hentati et al.，2021；曾超等，2020）；Candida albicans 39A2、Bacillus cereus CECT 193、Bacillus licheniformis CECT 491能產(chǎn)生脂蛋白表面活性劑（Haba et al.，2000）；Rhodococcus sp. 135、Pseudomonas sp. 25A3能產(chǎn)生脂肪酸類表面活性劑（Haba et al.，2000）；Klebsiella pneumoniae H1、Bacillus sphaericus EN3、Bacillus azotoformans EN16能產(chǎn)生磷脂類表面活性劑（Adamu et al.，2015；黃楊等，2015）；Candida antarctica T-34、Acinetobacter radioresistens KA53能產(chǎn)生聚合物表面活性劑（Kitamoto et al.，1990；Navon-Venezia et al.，1995）。但是尚未發(fā)現(xiàn)S. abikonense能夠產(chǎn)生生物表面活性劑的研究，這是首次關(guān)于S. abikonense產(chǎn)生脂肽類表面活性劑的報(bào)道。

2.5 不同的培養(yǎng)條件對(duì)菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的影響

生物表面活性劑作為細(xì)菌的一種次生代謝產(chǎn)物，其合成和分泌受環(huán)境條件影響較大（黃楊等，2015）。乳化指數(shù)（E24）與表面活性劑的濃度成正比，可采用 E24來表征菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的能力（Habib et al.，2020）。因此，有必要探討環(huán)境因子對(duì)GHP1菌株培養(yǎng)液E24的影響。

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的影響如圖8A所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)菌株培養(yǎng)液E24分布在51.59%—59.11%之間，呈現(xiàn)出先增加后減小的趨勢(shì)。其中，培養(yǎng)72 h菌株培養(yǎng)液的E24最高，與120 h的E24（P=0.065）無顯著性差異，但顯著高于168 h的E24（P=0.013）。這與已有的一些研究結(jié)果類似，Kumar et al.（2016）研究表明 Bacillus licheniformis在96 h的E24達(dá)到最大，繼續(xù)培養(yǎng)至120 h菌株培養(yǎng)液的E24下降；Hentati et al.（2021）發(fā)現(xiàn)Staphylococcus sp. CO100菌株培養(yǎng)192 h后，生物表面活性劑的產(chǎn)量下降。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)基中碳源減少，微生物利用生物表面活性劑作為細(xì)胞存活的底物導(dǎo)致的（Patowary et al.，2017）。

溫度影響細(xì)菌體內(nèi)酶的分泌和活性進(jìn)而影響微生物生長(zhǎng)及其生物表面活性劑的合成（Habib et al.，2020）。根據(jù)圖8B可知，不同溫度培養(yǎng)下菌株培養(yǎng)液的E24在51.70%—59.11%之間，在28 ℃條件下菌株培養(yǎng)液的 E24（59.11%）顯著高于 20 ℃（P=0.010）和 37 ℃（P=0.020）時(shí)的 E24，這說明28 ℃為 GHP1菌株的最佳生長(zhǎng)溫度，該菌在此溫度下生長(zhǎng)代謝速度最快，產(chǎn)生生物表面活性劑最多。同時(shí)也表明，GHP1菌株在20—37 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)良好并且產(chǎn)生生物表面活性劑。

pH與菌株產(chǎn)生生物表面活性劑密切相關(guān)（Parthipan et al.，2017）。根據(jù)圖8C可知，不同pH條件下菌株培養(yǎng)液的E24在52.95%—59.11%之間，pH 6.5和pH 8.0條件下菌株培養(yǎng)液的E24（P=0.368）無顯著性差異，pH 6.5條件下菌株培養(yǎng)液的 E24（59.11%）顯著高于pH 5.0、9.0、10.0（P值分別為0.001、0.001、0.001）的E24，pH 8.0條件下菌株培養(yǎng)液的 E24（57.17%）顯著高于 pH 5.0、9.0、10.0（P值分別為0.013、0.016、0.009）的E24。由此可見，菌株產(chǎn)生生物表面活性劑受 pH影響較大，GHP1菌株在pH為6.5—8.0條件下產(chǎn)生生物表面活性劑的能力最強(qiáng)，可能與該pH范圍更有利于生物表面活性劑的合成有關(guān)（石金禮等，2016）。其他菌株也有類似的結(jié)果，Achromobacter sp. A-8和Bacillus subtilis A1菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的最適pH 都為 7.0（Parthipan et al.，2017；Deng et al.，2020）。

碳源提供細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝所需要的能量，是維持細(xì)菌生長(zhǎng)和產(chǎn)生生物表面活性劑的基礎(chǔ)。碳源及其溶解度影響生物表面活性劑的產(chǎn)生（Khajavi-Shojaei et al.，2020）。從圖 8D 可知，GHP1菌株可以分別利用蔗糖、菲、玉米淀粉、柴油、菜籽油、潤(rùn)滑油、石蠟、甘油8種碳源生長(zhǎng)并產(chǎn)生生物表面活性劑，其中，蔗糖和玉米淀粉屬于糖類；柴油、菜籽油、潤(rùn)滑油、石蠟和甘油屬于油烴類；菲是PAHs的一種。GHP1菌株在不同的底物體系中培養(yǎng)液的E24不同，這是由菌體內(nèi)的酶系決定的（Mouafo et al.，2018）。以蔗糖為唯一碳源時(shí)，菌株培養(yǎng)液的E24最大（59.11%），顯著高于其他碳源培養(yǎng)液的E24（P=0.000）；以菲為唯一碳源時(shí)，E24最低（48.10%）；其他6種碳源分別添加的情況下，菌株培養(yǎng)液的E24均在52.00%左右。由上述結(jié)果可知，在糖、油烴、PAH三類碳源中，GHP1菌株在以糖為碳源時(shí)更易產(chǎn)生表面活性劑。已有研究表明，一部分菌以疏水性底物為碳源更易分泌表面活性劑，如Deng et al.（2020）研究的Bacteria Achromobacter sp. A-8在以食用油和石蠟為碳源時(shí)產(chǎn)生表面活性劑的能力最強(qiáng)；另一部分菌以水溶性底物為碳源更易分泌表面活性劑，如Parthipan et al.（2017）研究的 Bacillus subtilis A1在以蔗糖為碳源時(shí)產(chǎn)生表面活性劑的能力最強(qiáng)。GHP1菌株在以蔗糖為碳源時(shí)培養(yǎng)液的E24最高，可能是因?yàn)樵摼牦w內(nèi)分解蔗糖的酶占主導(dǎo)地位。

圖8 不同培養(yǎng)條件對(duì)培養(yǎng)液乳化性指數(shù)（E24）的影響Fig. 8 The effects of different culture conditions on emulsification index (E24) of culture medium

綜上所述，72 h、28 ℃、pH 6.5、蔗糖為碳源是 GHP1菌株產(chǎn)生生物表面活性劑的最適生長(zhǎng)條件，此時(shí)的E24為59.11%。GHP1菌株是從多年垃圾焚燒場(chǎng)地土壤中篩選出來的土著菌，在以各種類型的底物為碳源的培養(yǎng)基中都能生長(zhǎng)良好且產(chǎn)生生物表面活性劑（圖8），這說明該菌株對(duì)底物的接受范圍寬廣，菌株體內(nèi)酶系豐富，能吸收利用各種碳源。Basta et al.（2005）曾報(bào)道，Sphingomonad科菌株能夠利用多種類型的底物，適應(yīng)貧營(yíng)養(yǎng)環(huán)境。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象——S. abikonense GHP1隸屬于該科，該菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力強(qiáng)，易存活，在實(shí)際應(yīng)用中具有強(qiáng)大的競(jìng)爭(zhēng)力和明顯的優(yōu)越性。

3 結(jié)論與展望

本文從多年垃圾焚燒場(chǎng)地的土壤中篩選出一株菲高效降解細(xì)菌Sphingobium abikonense GHP1，該菌株能產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑，且在以蔗糖為唯一碳源、28 ℃、pH 6.5、培養(yǎng)72 h時(shí)其培養(yǎng)液的乳化指數(shù)最高。這是首次關(guān)于 Sphingobium abikonense菌株兼有降解菲和產(chǎn)生生物表面活性劑特性的報(bào)道。研究結(jié)果為環(huán)境中PAHs的污染修復(fù)和生物表面活性劑的生產(chǎn)提供新的菌源。

本研究探討了菌株GHP1在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下對(duì)菲的降解以及產(chǎn)生生物表面活性劑的情況。在自然環(huán)境條件下，影響PAHs污染微生物修復(fù)效果的因素非常復(fù)雜，菌株適應(yīng)外界環(huán)境條件、成功定殖并成為優(yōu)勢(shì)菌種是PAHs降解的關(guān)鍵。采用包埋、制成菌劑、附著可降解載體等手段增強(qiáng)菌株GHP1的環(huán)境適應(yīng)性及競(jìng)爭(zhēng)力并將其應(yīng)用于PAHs實(shí)際污染的修復(fù)還有待進(jìn)一步探究。