蘇晨玉， 胡 娜， 董 琦， 王洪倫，*

(1.中國科學院 西北高原生物研究所/藏藥研究重點實驗室， 青海 西寧 810008；2.青海省藏藥研究重點實驗室， 青海 西寧 810008； 3.中國科學院大學， 北京 100049)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科(Elaeagnaceae)沙棘屬(Hippophae)植物，具有耐干旱、耐鹽堿、耐貧瘠性等特征[1-2]，并具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值。沙棘含有黃酮類、三萜類、多糖和氨基酸等活性成分[3-4]，是一種藥食同源植物，在《晶珠本草》《藏藥志》等典籍中均有藥用記載。同時沙棘作為原料生產(chǎn)的副食品在市場上深受消費者青睞，目前有沙棘酸奶、沙棘果醋、沙棘冰酒和沙棘咀嚼片等產(chǎn)品?，F(xiàn)階段對沙棘的研究主要集中于沙棘果和沙棘葉等方面[5-8]，對沙棘果加工過程中產(chǎn)生的大量沙棘果渣研究和利用較少，造成了資源的浪費[9]。據(jù)文獻報道[10-12]，沙棘果渣中也含有豐富的生物活性成分，因此具有極高的研究價值。

通過高效液相色譜法可測定沙棘中含有的三萜酸類化合物類型[13]。三萜酸類化合物中，五環(huán)三萜酸以游離或苷類形式廣泛存在于自然界，是沙棘中含量最豐富的一種次級代謝產(chǎn)物，分為烏蘇烷型、齊墩果烷型、羽扇豆烷型和木栓烷型4種結(jié)構(gòu)類型，代表化合物有熊果酸、科羅索酸、山楂酸、齊墩果酸和樺木酸[14]。五環(huán)三萜酸類化合物有廣泛的藥理和生物活性作用[15-17]，具有降血糖、護肝、抗腫瘤、抗炎及免疫調(diào)節(jié)等功效。枇杷葉和夏枯草等植物中所含的熊果酸、科羅索酸和齊墩果酸通過對糖原磷酸化酶的抑制作用來降低血糖水平并對α-葡萄糖苷酶表現(xiàn)出抑制活性[18-21]。沙棘果渣中三萜酸類化合物含量豐富，總?cè)扑岷靠蛇_11.605 mg/g[22]，并且動物實驗結(jié)果顯示，沙棘果渣提取物對糖尿病大鼠表現(xiàn)出較好的療效[23]。

針對沙棘果渣利用率較低的現(xiàn)狀，本研究通過對沙棘果渣三萜酸進行富集，提高各組分中三萜酸的含量，對富集組分中三萜酸成分進行表征和含量測定，同時對其α-葡萄糖苷酶抑制活性進行評價，以期為沙棘果渣的進一步深度開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘果渣，青海康普生物科技股份有限公司；甲醇(色譜純) ，德國Merck公司；制備分離用球形十八烷基鍵合硅膠填料(ODS- A- HG)，粒徑50 μm、孔徑12 nm，日本YMC公司；阿卡波糖，上海源葉科技有限公司；α-葡萄糖苷酶(酵母來源)，美國Sigma公司；對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)，上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

AcquityTMultra型高效液相色譜儀，美國Waters公司；Triple TOF5600+型飛行時間質(zhì)譜(配有電噴霧離子源，ESI)，美國AB SCIEX公司；Eppendorf minispan型離心機，德國Eppendorf公司；EPOCH2型酶標儀，美國BioTek公司。

1.3 實驗方法

1.3.1沙棘果渣三萜酸的提取

將干燥的沙棘果渣粉碎后，按料液比(kg/L)1∶10加入體積分數(shù)95%乙醇，加熱回流提取3次，提取溫度70 ℃，每次1.5 h，過濾后合并濾液。將濾液減壓濃縮，即得沙棘果渣乙醇浸膏，-20 ℃冷凍保存。

1.3.2沙棘果渣三萜酸的富集

稱取沙棘浸膏1.0 kg，加入2 L蒸餾水，60 ℃水浴加熱溶解，靜置沉淀后過濾，濾渣干燥后即得三萜酸粗提物。取干燥后的粗提物6.20 g，加入甲醇溶解后過濾，與ODS按照質(zhì)量比1.0∶1.5拌樣并干燥。裝入減壓玻璃柱，依次使用3～5倍柱體積的體積分數(shù)20%、60%、80%、100%甲醇和氯仿- 甲醇溶液(體積比90∶10)按照流動相極性由大到小進行梯度洗脫。收集各部分餾分，并濃縮，干燥后即得不同極性富集物。

1.3.3沙棘果渣三萜酸含量的測定

使用香草醛冰乙酸法測定三萜酸含量，以齊墩果酸為標準品在紫外波長547 nm下測定吸光度，繪制標準曲線，并計算各富集組分的三萜酸含量[24]。

分別稱取干燥后的浸膏、粗提物、不同極性組分10.0 mg，加入少量甲醇溶解后，再加入無水乙醇定容至50 mL。每組進行3次平行實驗，取0.5 mL樣品溶液于具塞試管中，每種樣品取6份，3份為實驗組，3份為對照組，置于沸水浴揮干溶劑后，實驗組與對照組均加入1.6 mL高氯酸，而后實驗組加入質(zhì)量分數(shù)5%的香草醛- 冰乙酸溶液0.4 mL，實驗組和對照組均在70 ℃下反應15 min，最后實驗組、對照組分別加入8.0 mL和8.4 mL冰乙酸終止反應，于547 nm處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算三萜酸含量。

1.3.4HPLC-Q-TOF-MS/MS實驗條件設定

1.3.4.1 液相條件

稱取三萜酸含量最高的組分7.5 mg，1 mL甲醇- 水溶液(體積比80∶20)溶解后，過0.45 μm濾膜用于測試。色譜柱：Agilent SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇- 水溶液(體積比85∶15)，等度洗脫，流速為0.8 mL/min，檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃。

1.3.4.2 質(zhì)譜條件

負離子掃描模式，離子源溫度550～600 ℃；離子源電壓為4 500～5 500 V；掃描范圍m/z100～1 500。

1.3.5α-葡萄糖苷酶抑制活性測定

參照文獻[25]的方法并改良，實驗分為空白組、對照組、樣品組和樣品空白組，各反應物按表1中的劑量加入96孔板，每組進行3次平行實驗，將待測試劑、磷酸緩沖液和酶溶液混合均勻，在恒溫振蕩器中37 ℃保溫10 min，加入50 μL 0.5 mmol/LpNPG溶液，充分混勻，于37 ℃反應10 min，最后加入50 μL 0.1 mol/L的Na2CO3溶液終止反應，在405 nm波長下測定吸光度，根據(jù)式(1)計算各組α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50。

(1)

式(1)中，AC為空白組吸光度，AB為對照組吸光度，AS為樣品組吸光度，ASB為樣品空白組吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均重復3次，結(jié)果表示為平均值±標準差。差異顯著性分析采用Graph Pad 8.0軟件進行，繪圖采用Origin 9.0軟件。

表1 酶活性抑制實驗設計Tab.1 Design of enzyme activity inhibition experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘果渣三萜酸的富集與含量測定結(jié)果

通過ODS減壓富集共得6個不同的極性組分，分別命名為F1～F6。其中，20%甲醇洗脫為F1組分；60%甲醇洗脫為F2組分；80%甲醇洗脫為F3組分；純甲醇洗脫時，明顯分為2個不同顏色的色帶，其中首先被洗脫下來的色帶為F4組分，最后被洗脫下來的色帶為F5組分；氯仿- 甲醇洗脫得到的組分為F6。

以標準品質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程為y=2.835 8x-0.019，R2=0.998 8，由此計算沙棘果渣各極性組分總?cè)扑岬暮?，如?。經(jīng)過富集共得三萜酸粗提物179.12 g，取6.20 g粗提物進行減壓富集后，共得三萜酸含量較高的F3組分0.51 g，F(xiàn)4組分1.75 g，其三萜酸的質(zhì)量分數(shù)分別為63.24%和75.01%，說明沙棘果渣中的三萜酸主要集中在低極性組分中，ODS減壓富集可快速高效地將化合物按照不同極性進行富集，且具有較高的回收率，F(xiàn)4組分三萜酸回收率為51.30%。

表2 富集組分中三萜酸含量Tab.2 Triterpene acid contents in enriched components %

2.2 沙棘果渣富集組分F4的特征分析

由于F4組分三萜酸含量最高，故利用HPLC- Q- TOF- MS/MS對富集后的組分F4進行了分析，以明確其特征成分，其液相色譜和總離子流圖分別如圖1和圖2。組分F4經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)主要含有11種五環(huán)三萜類化合物，結(jié)果見表3。

圖1 組分F4的HPLC分析Fig.1 HPLC analysis of component F4

根據(jù)Scifinder和Reaxy數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)合分子離子峰和二級質(zhì)譜碎片離子峰，推測出化合物類型。化合物1的m/z487 (M-H)-m/z469(M-H2O)豐度值較高，對比結(jié)果為化合物2α,3β,24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸。對比文獻[26]，化合物10和11為差向異構(gòu)體齊墩果酸和熊果酸，齊墩果酸由于相鄰2個甲基空間結(jié)構(gòu)的影響，造成m/z439(M2-H2O)-m/z421 (M3-H2O)豐度值較高；而熊果酸和化合物5中m/z411 (M3-HCOOH)-m/z393 (M4-H2O)和m/z455 (M3-HCOOH)-m/z409(M4-H2O)豐度值較為突出?；衔?與10、5與11間相對分子質(zhì)量相差16，且具有相同的裂解規(guī)律，因此，推測化合物4為山楂酸，化合物5為科羅索酸?；衔?～9比山楂酸相對分子質(zhì)量增加了146，結(jié)合文獻[27-30]和碎片峰信息可推測為香豆酰三萜酸，即化合物6～9分別為山楂酸和科羅索酸的衍生物。

圖2 組分F4的總離子流圖Fig.2 Total ion chromatogram of component F4

表3 HPLC- Q- TOF- MS/MS表征組分F4中的三萜酸

2.3 三萜酸提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性分析

不同極性組分對α-葡萄糖苷酶的IC50測定結(jié)果見表4。由表4可知，除組分F1抑制活性極顯著低于陽性對照阿卡波糖外，沙棘果渣粗提物及組分F2～F6均對α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制活性，且都極顯著高于陽性對照組阿卡波糖。組分F4抑制活性最強，IC50僅為0.040 mg/mL；其次為組分F3，IC50為0.047 mg/mL。由于組分F1三萜酸含量遠遠低于其他組分，因此其抑制活性較差，IC50大于2.000 mg/mL。結(jié)果表明，不同組分對α-葡萄糖苷酶的抑制活性與三萜酸含量呈正相關(guān)。

表4 不同組分對α-葡萄糖苷酶活性的半抑制濃度Tab.4 Semi-inhibitory concentration of different components mg/mL

3 結(jié) 論

目前對三萜酸類化合物的富集多采用大孔樹脂乙醇洗脫法。在純化過程中多采用水溶液進行上樣吸附，由于提取液成分復雜，化合物極性較小等原因，樣品溶解性較差，容易造成樹脂的污染和堵塞，因此，上樣前需進行預處理，且上樣濃度不能過大，導致富集效率較低[31-34]。本研究采用的ODS減壓洗脫法與固相萃取有類似之處，二者均為減壓條件下進行梯度洗脫。蔣紅紅[35]研究發(fā)現(xiàn)，固相萃取法對白頭翁中的五環(huán)三萜皂苷類化合物的富集具有良好的回收率。ODS減壓洗脫法采用拌樣吸附進行干法上樣，改善了樣品溶解性較差的問題，并且增大了上樣量，ODS法的上樣量遠遠大于固相萃取法，再通過甲醇- 水溶液進行梯度洗脫，實現(xiàn)了不同極性組分的分離與富集。同時，該方法具有良好的穩(wěn)定性和重復利用性。結(jié)果表明：ODS減壓洗脫法富集后，F(xiàn)4組分三萜酸質(zhì)量分數(shù)提高到了75.01%，且具有較高的回收率，達到51.30%。同時結(jié)合液- 質(zhì)聯(lián)用色譜分析對F4組分所含三萜酸成分進行表征，結(jié)果顯示：F4組分含有11種五環(huán)三萜類化合物，表明ODS減壓洗脫法對極性較小的五環(huán)三萜類化合物具有良好的富集效果。

研究發(fā)現(xiàn)：植物中的三萜酸類成分對α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制活性，其中熊果酸對α-葡萄糖苷酶有顯著的抑制活性，其IC50僅為0.76 μg/mL，科羅索酸和齊墩果酸的IC50分別為1.14、1.27 μg/mL[36-37]，因此，推測F4組分中的熊果酸、科羅索酸和齊墩果酸這3種五環(huán)三萜對α-葡萄糖苷酶活性的抑制發(fā)揮了主要的作用。本研究通過一步步提高富集組分三萜酸含量，并進行不同組分對α-葡萄糖苷酶的抑制實驗，發(fā)現(xiàn)隨著三萜酸含量的提高，富集組分對α-葡萄糖苷酶的抑制作用也隨之增強，且顯著高于藥物對照組阿卡波糖，表明三萜酸類化合物具有降低糖尿病人餐后血糖的潛在活性。