曲鵬輝， 滕 超,，*， 鹿發(fā)展， 張小涵， 夏韓碩，范光森， 李秀婷,，*

(1.北京工商大學(xué) 食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室, 北京 100048；2.北京工商大學(xué) 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心, 北京 100048)

小麥麩皮是小麥制粉過(guò)程中主要的副產(chǎn)物，約占小麥籽粒的22%～25%，富含多種功能成分，如膳食纖維、蛋白質(zhì)、黃酮類和酚酸類等。然而，目前大部分小麥麩皮主要作為醋、醬油或飼料等其他廉價(jià)產(chǎn)品的原料。

小麥麩皮的主要成分包含46%的非淀粉多糖，其中阿拉伯木聚糖約為70%，是麥麩中重要的生理活性物質(zhì)。木聚糖作為一種可再生的天然半纖維素，由β-D-吡喃木糖殘基通過(guò)β-1，4糖苷鍵連接而成主鏈，阿拉伯糖、葡糖醛酸、4-O-甲基醚或乙酸等其他基團(tuán)與主鏈相連形成側(cè)鏈[1]。木聚糖具有溶解性、氧化凝膠性等優(yōu)良理化特性，及抗氧化[2]、降血糖[3]、降血脂[4]和調(diào)節(jié)免疫力[5]等功效，在食品、化工和醫(yī)療等領(lǐng)域中應(yīng)用潛力巨大。木聚糖酶是半纖維素酶體系中一種極為重要的酶，催化木聚糖骨架中β-1，4 糖苷鍵的斷裂水解，生成低聚木糖。木聚糖的主鏈聚合度、取代度、側(cè)殘基和側(cè)鏈長(zhǎng)度等結(jié)構(gòu)的不同，其理化性質(zhì)也會(huì)存在明顯差異。

目前，研究多集中在麥麩無(wú)糖的提取工藝優(yōu)化，對(duì)其木聚糖理化性質(zhì)的系統(tǒng)分析較少。本研究采用高溫蒸煮及乙醇分級(jí)沉淀的方法，從小麥麩皮中提取到4種小麥麩皮木聚糖組分，系統(tǒng)地對(duì)這4種木聚糖組分的相對(duì)分子質(zhì)量、官能團(tuán)及顯微結(jié)構(gòu)等進(jìn)行分析，并通過(guò)耐熱木聚糖酶對(duì)木聚糖進(jìn)行酶解，研究酶解前后木聚糖體外抗氧化活性的變化，旨在探索影響和提升木聚糖抗氧化性能的方法及規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥麩皮，河北五得利面粉集團(tuán)有限公司；木聚糖酶，北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心保藏的嗜熱真菌TalaromycesthermophilusF1208發(fā)酵所得；耐高溫α-淀粉酶，北京索萊寶科技有限公司；Protamax復(fù)合蛋白酶，諾維信酶制劑公司；葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma試劑公司；國(guó)產(chǎn)色譜純乙腈，國(guó)產(chǎn)分析純無(wú)水乙醇、三氟乙酸、甲醇、氯仿、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、PMP、硝酸鈉，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-6型高溫高壓反應(yīng)釜，德國(guó)優(yōu)萊博公司；Free zone 4.5plus型真空冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco公司；Nicolet IS50型傅里葉變換紅外光譜儀、多功能酶標(biāo)儀，Thermo Scientific公司；1260型高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；超高效聚合物色譜系統(tǒng)，美國(guó)Waters公司；SU8010型掃描電子顯微鏡，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1麥麩木聚糖的制備

麩皮與蒸餾水的料液比(g/mL)為1∶12，Protamax復(fù)合蛋白酶的加酶量為麩皮質(zhì)量的3%，在45 ℃下水浴振蕩酶解2 h，加1.5%(以麩皮質(zhì)量計(jì))的耐高溫α-淀粉酶，在100 ℃條件下，酶解30 min，碘液驗(yàn)證淀粉是否完全水解。烘干至恒重制得去淀粉、脫蛋白的麥麩，粉碎，以料液比(g/mL)1∶15與去離子水混合，設(shè)置反應(yīng)釜的參數(shù)為溫度170 ℃，保溫時(shí)間0 min。高溫蒸煮結(jié)束后，冷卻至室溫以8 000 r/min離心15 min，液體濃縮至一定體積。

1.3.2麥麩木聚糖組分的分離

采用乙醇分級(jí)沉淀法分離麥麩木聚糖[6]。在高溫蒸煮后的木聚糖提取液中加入乙醇，由低到高依次調(diào)整乙醇體積分?jǐn)?shù)至40%、60%、80%和90%。每次調(diào)節(jié)后，將混合液于4 ℃冰箱中靜置1 h，8 000 r/min離心10 min，固體沉淀進(jìn)行冷凍干燥，得到4種木聚糖組分分別標(biāo)記為EXy40、EXy60、EXy80和EXy90。

1.3.3麥麩木聚糖組分相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[7]，將4種麩皮木聚糖組分配置成1 mg/mL的水溶液，用于超高效凝膠滲透色譜APC聯(lián)用多角度激光散射儀測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量分布。流動(dòng)相為20 mmol/L硝酸鈉溶液，流速為0.35 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量20 μL；色譜柱為ACQUITY APC 200、ACQUITY APC 250和ACQUITY APC 400(三柱串聯(lián))。

1.3.4麥麩木聚糖傅里葉變換紅外光譜分析

取少量不同麥麩木聚糖組分樣品，置于傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定，掃描范圍為400～4 000 cm-1。

1.3.5麥麩木聚糖單糖組成測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]，稱取2.5 mg樣品于5 mL安瓿瓶中，加入2 mol/L的三氟乙酸1 mL，熔封，110 ℃水解2 h，結(jié)束后在坩堝中蒸發(fā)至無(wú)酸性氣味，加入1 mL蒸餾水，吸取250 μL水解液，再加入等體積的0.6 mol/L NaOH和500 μL PMP-甲醇溶液(0.4 mol/L)，70 ℃下水浴1 h，冷卻至室溫后，加入500 μL HCL溶液(0.3 mol/L)中和，加入1 mL氯仿振蕩，靜置，棄下層有機(jī)相， 重復(fù)萃取3次以上，將萃取后的上清液用0.22 μm 有機(jī)濾膜過(guò)濾后用于上樣。

取衍生化的樣品溶液及標(biāo)準(zhǔn)品用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測(cè)分析，檢測(cè)條件：色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH值 6.9)-乙腈溶液(體積比83∶17)，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，等梯度洗脫。

1.3.6木聚糖酶酶解條件優(yōu)化

將4種木聚糖組分分別配置成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液，加入木聚糖酶對(duì)木聚糖進(jìn)行酶解，DNS法測(cè)定酶解液中還原糖含量，并以還原糖含量為指標(biāo)，采用單因素輪換法依次考察pH值、酶解時(shí)間、加酶量和酶解溫度對(duì)木聚糖酶酶解特性的影響。

1.3.7酶解產(chǎn)物薄層色譜分析

將4種木聚糖組分按優(yōu)化酶解條件充分酶解后，酶解產(chǎn)物加入陰陽(yáng)離子樹(shù)脂，吸附過(guò)夜，點(diǎn)樣于薄層色譜板，于展開(kāi)槽中展開(kāi)2次，吹干，放入顯色劑中顯色。以V(正丁醇)∶V(醋酸)∶V(水)=2∶1∶1為展開(kāi)劑，V(硫酸)∶V(甲醇)=20∶1為顯色劑。

1.3.8體外抗氧化活性測(cè)定

1) DPPH·清除能力測(cè)定[9]：吸取100 μL DPPH-乙醇溶液(0.5 mmol/L)與不同質(zhì)量濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)的木聚糖溶液等體積混合，放置黑暗處30 min并不斷振蕩，在517 nm用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品反應(yīng)液的吸光度，以相同質(zhì)量濃度的維生素C(Vc)為陽(yáng)性對(duì)照。清除率按式(1)計(jì)算。

清除率=[1-(Ai-Aj)/A0] × 100% 。

(1)

式(1)中，A0，蒸餾水代替樣品溶液吸光度；Aj，無(wú)水水醇代替DPPH-乙醇時(shí)樣品溶液的吸光度；Ai，待測(cè)樣品溶液吸光度。

2) ·OH清除能力測(cè)定[10]：將0.5 mL木聚糖樣品溶液(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL)與0.5 mL FeSO4(6 mmol/L)和0.5 mL水楊酸-乙醇溶液(6 mmol/L)混合，加入0.5 mL過(guò)氧化氫溶液(6 mmol/L)，37 ℃水浴30 min后，取上清液，在510 nm處用酶標(biāo)儀立即測(cè)定樣品反應(yīng)液的吸光度，以相同質(zhì)量濃度的維生素C為陽(yáng)性對(duì)照。清除率計(jì)算同式(1)，此時(shí)，Aj為用蒸餾水代替過(guò)氧化氫的樣品溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用 Microsoft、Origin及SPSS軟件整理分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

木聚糖的生理活性與其相對(duì)分子質(zhì)量有關(guān)，分級(jí)醇沉可以有效分離具有不同相對(duì)分子質(zhì)量和木糖殘基取代度的木聚糖。通過(guò)高溫蒸煮并乙醇分級(jí)沉淀得到4種木聚糖組分(EXy40、EXy60、EXy80、EXy90)，各木聚糖組分得率依次為6.51%、5.64%、5.13%和1.34%(相對(duì)于預(yù)處理后麩皮的質(zhì)量)。與較高體積分?jǐn)?shù)的乙醇相比，較低體積分?jǐn)?shù)的乙醇可以沉淀出更多的木聚糖級(jí)分。

2.1 木聚糖酶酶解條件優(yōu)化結(jié)果

木聚糖的優(yōu)化酶解條件如表1，酶解后的樣品進(jìn)行真空冷凍干燥至恒重，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

表1 木聚糖酶的優(yōu)化酶解條件Tab.1 Optimal enzymolysis conditions of xylanase

2.2 理化性質(zhì)分析

2.2.1麥麩木聚糖組分的相對(duì)分子質(zhì)量分析

通過(guò)凝膠滲透色譜法(GPC)測(cè)定乙醇分級(jí)沉淀法提取的4種木聚糖組分的重均分子量(MW)、數(shù)均分子量(MN)和多分散性系數(shù)(MW/MN)，結(jié)果見(jiàn)表2。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從40%增加到60%時(shí)，MW和MN明顯增大；在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，木聚糖的MW和MN最大，分別為3.119×104和1.535×104；進(jìn)一步提高乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，MW和MN均大幅度降低。木聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量對(duì)其生理活性有著重要影響，低相對(duì)分子質(zhì)量的木聚糖分支少易聚集，從而具有較高的黏度和良好的生理特性；而高相對(duì)分子質(zhì)量的木聚糖具有更高的抗氧化活性[11]。其次，隨著醇沉體積分?jǐn)?shù)的增加，MW/MN逐漸減小，EXy80和EXy90的MW/MN均低于1.5，說(shuō)明其相對(duì)分子質(zhì)量分布很窄。由此可得，高溫蒸煮并乙醇分級(jí)沉淀制備得到了相對(duì)分子質(zhì)量分布窄、多分散性系數(shù)小的木聚糖；而這類多分散性系數(shù)小于3的多聚糖在商業(yè)上有很大的應(yīng)用潛力。

表2 4種木聚糖組分的重均、數(shù)均分子量和多分散性系數(shù)Tab.2 Weight-average and number-average molecular weights and polydispersity coefficient of four xylan components

2.2.2麥麩木聚糖組分的紅外光譜分析

4種木聚糖組分EXy40、EXy60、EXy80和EXy90的紅外光譜如圖1。4種木聚糖組分在3 343 cm-1附近處均有較寬的吸收峰，為纖維素、半纖維素中O—H 的收縮振動(dòng)；2 800～3 000 cm-1處為多糖分子中甲基或亞甲基中C—H伸縮振動(dòng)的吸收峰[12]；在1 635 cm-1處吸收峰為木質(zhì)素中苯環(huán)的特征吸收峰；在1 248 cm-1處吸收峰表示纖維素和半纖維素中C—O的變形振動(dòng)；在1 010～1 050 cm-1處吸收峰表示小麥麩皮木聚糖組分中含有吡喃糖[13]；在890～900 cm-1處吸收峰表示β-D-吡喃糖苷鍵中C—H變角振動(dòng)的吸收峰。結(jié)果表明：采用乙醇分級(jí)沉淀制備的4種麥麩木聚糖組分的特征官能團(tuán)無(wú)顯著性差異，且均為多糖的典型基團(tuán)。

圖1 4種木聚糖組分的FT-IR光譜Fig.1 FT-IR spectra of four xylan components

2.2.3麥麩木聚糖組分的單糖組成分析

乙醇沉淀法制備麥麩木聚糖的單糖組分含量分析見(jiàn)表3。4種麩皮木聚糖組分中，糖組成成分包括12.94%～43.78%木糖、20.35%～42.44%阿拉伯糖、5.44%～20.95%葡萄糖、2.12%～12.90%甘露糖和3.06%～8.32%半乳糖，而葡萄糖醛酸僅為1.39%～3.99%。葡萄糖可能來(lái)自葡糖醛酸、阿拉伯木聚糖和木葡聚糖，而半乳糖來(lái)自阿拉伯半乳聚糖，少量的葡萄糖醛酸可能是4-O-甲基葡萄糖醛酸以支鏈的形式存在。阿拉伯糖和木糖的摩爾比值常用來(lái)表示木聚糖聚合物的線性或分支程度[14]，且該值對(duì)木聚糖的溶解度也有重要影響，比值越大木聚糖的溶解度越好，分支度越低。由表3可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)從40%增加到90%，阿拉伯糖和木糖的摩爾比值從0.58增加到1.57，說(shuō)明隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，更多支化的木聚糖被沉淀出來(lái)，即支鏈木聚糖在較高乙醇體積分?jǐn)?shù)下獲得的更多。田貝貝等[15]研究結(jié)果指出：基于不同分子質(zhì)量和分支結(jié)構(gòu)的阿拉伯木聚糖在乙醇中的溶解度不同，分級(jí)醇沉能夠獲到不同相對(duì)分子質(zhì)量、阿拉伯糖和木糖的摩爾比值及木糖殘基取代度的木聚糖，與本研究結(jié)果一致。由此可得，不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇沉淀能夠有效分離出不同分子結(jié)構(gòu)及單糖比例的小麥麩皮木聚糖。

表3 4種木聚糖組分中糖基和糖醛酸的含量Tab.3 Contents of glycosyl and uronic acids of four xylan components

2.2.4木聚糖酶解產(chǎn)物的薄層色譜分析

采用木聚糖酶對(duì)4種麥麩木聚糖組分進(jìn)行酶解，酶解產(chǎn)物進(jìn)行薄層色譜(TLC)分析，結(jié)果如圖2。木聚糖酶對(duì)不同分子結(jié)構(gòu)的木聚糖進(jìn)行酶解，酶解產(chǎn)物的種類和含量皆不同。由圖2(a)可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增加，各木聚糖組分酶解后還原糖含量逐漸降低，EXy40組分酶解后得到的還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，為303 mg/g；其次為EXy60、EXy80和EXy90木聚糖組分，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為178、76、52 mg/g。由圖2(b)可知，酶解后EXy40木聚糖組分含有木糖、阿拉伯糖、木二糖、木四糖和木五糖，酶解產(chǎn)物種類較多；EXy60木聚糖組分含有木糖、阿拉伯糖和木四糖；EXy80和EXy90木聚糖組分僅含有少量木糖和阿拉伯糖，種類相對(duì)較少。說(shuō)明木聚糖酶水解較低乙醇體積分?jǐn)?shù)醇沉得到的木聚糖時(shí)，可以產(chǎn)生大量的活性低聚糖。有研究表明：當(dāng)木聚糖酶水解不同結(jié)構(gòu)和組成成分的木聚糖時(shí)，由于木聚糖酶空間結(jié)構(gòu)的容納性，導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合方式改變，從而引起產(chǎn)物變化。

圖2 4種木聚糖組分酶解后還原糖含量和TLC分析Fig.2 Contents of reducing sugar and TLC analysis after enzymatic hydrolysis of four xylan components

圖3 4種木聚糖組分酶解前后的DPPH·清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging rate before and after enzymolysis of four xylan components

2.3 酶解前后木聚糖體外抗氧化活性分析

2.3.1DPPH·清除能力分析

酶解前后4種木聚糖組分清除DPPH·的能力如圖3。由圖3(a)可知，質(zhì)量濃度0.5～2.5 mg/mL時(shí)，4種木聚糖組分對(duì)DPPH·的清除效果隨質(zhì)量濃度的增加而提高。其中，EXy90木聚糖組分清除能力較強(qiáng)，質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí)，DPPH·的清除率達(dá)到85%。由圖3(b)可知，酶解后各木聚糖組分對(duì)DPPH·的清除能力整體趨勢(shì)基本沒(méi)有改變，EXy90木聚糖組分依然是4個(gè)組分中清除能力最高的，其次為EXy80和EXy60木聚糖組分。但與水解前相比，清除能力都有所降低。有文獻(xiàn)報(bào)道：木聚糖酶隨機(jī)水解木聚糖鏈，產(chǎn)生不同聚合度和取代度的低聚木糖，使木聚糖相對(duì)分子質(zhì)量降低，而相對(duì)分子質(zhì)量較高的木聚糖抗氧化能力更好[2]。Valls等[11]研究表明：桉樹(shù)木聚糖的抗氧化活性隨低聚木糖的長(zhǎng)度的減小而降低，即抗氧化活性會(huì)隨著低聚木糖聚合度的降低而降低。因此，酶水解使木聚糖聚合度、取代度及相對(duì)分子質(zhì)量降低，可能是抗氧化活性降低的原因。

2.3.2·OH清除能力分析

酶解前后4種木聚糖組分清除·OH的能力如圖4。由圖4(a)可知，質(zhì)量濃度0.5～2.5 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增加，各木聚糖組分對(duì)·OH清除能力呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，且4種木聚糖組分對(duì)·OH清除效果相差不大，均處于較低水平。由圖4(b)可知，酶解后各木聚糖組分在0.5～2.5 mg/mL，隨質(zhì)量濃度的增加，·OH清除率迅速增加后趨于平緩；且相比酶解前，清除效果大幅度提高，其中EXy90、EXy80和EXy40木聚糖組分具有較高的·OH清除率，質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL以上時(shí)，均能達(dá)到97%左右。

圖4 4種木聚糖組分酶解前后的·OH清除率Fig.4 OH free radical scavenging rate before and after enzymolysis of four xylan components

4種木聚糖組分抗氧化活性的不同在于其相對(duì)分子質(zhì)量、單糖比例和分支結(jié)構(gòu)的差異。酶解前，與DPPH·清除能力相比，4種木聚糖組分的·OH清除能力相對(duì)較弱，原因在于自由基清除的作用機(jī)理不同，DPPH·清除率的測(cè)定是基于自身電子轉(zhuǎn)移；而·OH清除率的測(cè)定是基于絡(luò)合機(jī)理，且可能受多方面因素的影響，有待于進(jìn)一步研究。酶解后4種木聚糖組分的·OH清除能力大幅度提高，抗氧化活性改變，可能是因?yàn)槟揪厶敲傅乃庾饔檬鼓揪厶墙M分的聚合度、取代度及相對(duì)分子質(zhì)量降低。

3 結(jié) 論

本研究采用高溫蒸煮對(duì)小麥麩皮進(jìn)行處理，并對(duì)蒸煮液進(jìn)行乙醇分級(jí)沉淀，經(jīng)離子色譜、FT-IR、單糖組成分析，明確了4種木聚糖組分組成，即以木糖和阿拉伯糖為主，且相對(duì)分子質(zhì)量分布較窄，多分散性系數(shù)較小。采用酶法修飾木聚糖組分，顯著提升了木聚糖組分對(duì)·OH的清除能力。研究結(jié)果旨在為開(kāi)發(fā)具有高抗氧化活性的木聚糖資源提供新的方向。